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影响大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养因素的研究 |
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及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。
大鼠胚胎黑质多巴胺能神经元的原代培养有相当难度。据报道，在胚胎中脑原代细胞培养中所得到的多巴胺能神经元所占的比例一般较低，多为0.5%～2%［1，2］(仅有一个实验室报道达到了17%［3］)；另外，这些体外培养神经元的形态和功能与体内有较大差异。这些都会影响体外实验结果的准确性。
产生上述现象可能与多种原因有关。首先，大多数作者使用的取材方法是取下整个胚胎中脑或中脑腹侧，从而不可避免地混有大量不含多巴胺能神经元的组织。其次，原代培养黑质多巴胺能神经元与培养的海马、大脑皮质神经元不同，较容易死亡［4］。有报告说，胚胎黑质细胞在分散过程中即可造成30%的多巴胺能神经元死亡，接种后24h内死亡最多，为接种时存活的多巴胺神经元的60%，其后死亡进程延缓，第3d为87%［5］。尽管不同作者所报告的数字略有差异，但第3d死亡数至少要达50%以上［6］，第8d则超过75%［7］。另外，多聚左旋赖氨酸虽然常被用作体外培养的基质，但并不是细胞外基质的成分，其作用仅仅是通过改善培养皿的电荷状况及吸附培养液中的某些血清成分，以促进细胞贴附［8］，从而造成神经元的生长形态及功能的不稳定性。
为此，我们在本实验中，拟从取材部位、细胞接种液和培养基质3方面对黑质多巴胺能神经元的技术进行改进，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养物。
材料和方法
1. 收集3T3成纤维细胞系条件培养液
在玻璃培养瓶中，以含胎牛血清10%(Gibco)，青霉素105IU/L，链霉素100mg/L，葡萄糖4.5g/L的DMEM(Gibco)培养3T3成纤维细胞系。换液时，收集旧培养液，2 000×g离心5min。取上清，储存于4℃，用作黑质神经元原代培养接种液中的添加剂。
2. 铺敷生长基质
2.1 Poly-L-Lysine:在35mm塑料培养皿(Nunc,USA)中加入50mg/L的PLL 0.5ml(Sigma,MW=70～150kD)，室温作用12～24h后，吸去多余液体，用无菌去离子水彻底冲洗3次，置于37℃培养箱(Heraeus,Germany)中待用。
2.2 Matrigel:4℃，24h融化Matrigel(Becton Dickison Labware,USA)，用不含血清的预冷培养液按1∶100稀释，然后用预冷的吸管混匀，在预冷的35mm塑料培养皿中加入Matrigel稀释液0.5ml，37℃培养箱孵育1h后，吸去多余的液体，并用无菌去离子水冲洗1次后，即刻使用。注意切勿使铺敷的Matrigel干燥。
3. 胚胎黑质神经元取材
取孕13d SD大鼠1只(北京医科大学实验动物中心，以见阴栓为第0d)，心脏内直接注射气栓处死；无菌条件下取出子宫，用冰D-Hank液洗净，再经75%酒精洗浴30s，置于盛有冰D-Hank液的平皿中；沿子宫系膜对侧缘剪开子宫，取出胚胎，测量头臀距(CRL)为11mm，共15只，置于冰袋上盛有冰D-Hank液的平皿中待用。在解剖镜(Cambridge Instruments,Germany)下，暴露中脑脑曲；用显微手术剪剪下中脑脑曲腹侧部分(其吻侧界限为中脑与间脑的交界线的尾侧1mm)，将取下的组织平铺在平皿中，用显微手术镊剥除脑膜及血管，用显微手术剪剪下其距吻侧端1mm中线两侧各1.5mm×1.5mm的组织(所取组织块长宽分别为1.5mm和3mm)，放入盛有冰D-Hank液的平皿中，静置于冰袋上待用。整个取材时间(从取出大鼠子宫到全部取材完成)不超过45min。
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