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实验性铅中毒对睾丸神经生长因子基因表达的影响 |
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中NGF mRNA含量的变化，以探讨铅对睾丸组织NGF基因表达的影响。
材料和方法
1.动物和试剂
健康雄性ICR小鼠，1月龄，由南通医学院实验动物中心提供。
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、RNA提取试剂(Trizol)、第一链cDNA合成试剂盒(SuperScriptTM Preamlification System for First Strand cDNA Synthesis Kit)购自GibcoBRL公司；地高辛标记试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit)购自Bboehringer Mannheim公司；硫酸葡聚糖、鱼精DNA、甲酰胺等试剂购自Sigma公司；一般化学试剂购自上海试剂公司。
2.引物的合成
按NGF基因DNA序列，以中国科学院上海植物生理研究所合成的2个寡核苷酸为引物，其编码区为38～56和380～398，预期扩增产物为360bp。引物1：5’-GAATTCTCGGTGTGTGACA-3 ;引物2：5 -CTATCTCACAGCCTTCCTG-3 。以G3PD (甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase)作为内参，引物序列为：引物1：5’－GGTGAAGGTGGGTGTCAAC-3 ；引物2：5’-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3 。预期扩增产物长度为200bp。
3.铅中毒模型的制备
小鼠16只，随机分成2组(每组8只)：一组为正常对照组，以去离子水自由饮服；另一组为铅染毒组，以0.5%醋酸铅水溶液自由饮服，染毒时间为8周。
4.血铅、睾丸铅含量的测定及组织病理学检查
采用原子吸收分光光度法分别测定染毒组和对照组小鼠血铅和睾丸组织铅含量。取睾丸组织经HE染色，光镜检查。
5.Dig-β NGF DNA探针制备
将360 bp的β NGF DNA片段，克隆人pUC19质粒，转染JM13大肠杆菌，体外扩增，按碱性裂解法提取质粒DNA。将质粒DNA稀释后作为模板，采用上述NGF引物，在Cetus公司的PCR仪上，通过PCR DNA扩增，用直接标记法制备Dig-β NGF cDNA探针［9］。
6.原位杂交
小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌流固定，取睾丸组织后固定，常规冰冻切片(厚约15 μm)，按文献［9，10］的方法，进行原位杂交。
7.RT-PCR
7.1 总RNA提取：采用Trizol试剂提取正常对照组和染毒组小鼠睾丸组织总RNA。每个样品均经甲醛变性胶电泳检测其RNA的完整性。采用日本岛津UV2200紫外分光光度仪，检测各样品中总RNA的含量。
7.2 第1链cDNA的合成：分别取对照组和染毒组小鼠睾丸组织总RNA各5 μg,依次加入10μmol/L 01igo(dT)12～18 1μl，DEPC水适量，使总体积达12μl，于70℃加热10min，冰浴2min。再加入：10×PCR缓冲液2μl、25mmol/L MgCl2 2μl、10mmol/L dNTPmix 1μl、0.1mol/L二硫苏糖醇(DDT) 2μl。轻轻混匀后于42℃孵育5min，再加入SuperScript Ⅱ反转录酶1μl(2×106IU/L)，于42℃孵育50min。70℃加热15min终止反应。置-20℃保存备用。
7.3 PCR：以第1链cDNA 2μl为模板，依次加入NGF引物(10pmol/L)各1μl，2mmol/L dNTPmix 4μl,10×PCR缓冲液 5μl，双蒸水34.5μl，TaqDNA聚合酶0.5μl(5×106 IU/L)，反应总体系为50μl。95℃预变性3min。PCR反应条件为：95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸40s，循环32次。每个反应体系中，均加入G3PD的一对引物(10pmol/L)为PCR扩增的内参。以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测NGF扩增产物(360bp)和G3PD扩增产物(200bp)。经凝胶图像分析系统，对各组RT-PCR产物的电泳条带进行密度分析。
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