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晚期糖化终产物对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的影响 |
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the synthetic one, and AGEs is an important factor for this changes.
【Key words】 Diabetes mellitus; Advanced gycation end products; Vascular smooth muscle cell;Rat
血管病变是糖尿病慢性并发症的主要病理表现，包括微血管病变和大血管病变。后者在早期主要是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和胶原纤维增多，弹性纤维减少，动脉增厚等，引起动脉的顺应性降低，舒张功能减弱［1～3］;晚期主要表现为动脉粥样硬化和动脉硬化，其中以VSMC的增生和迁移较为突出，其表型也由收缩型转化为合成型［4，5］。VSMC的表型转化是血管病变发展为动脉粥样硬化的重要步骤，这种转化在糖尿病早期是否已经发生，未见报道。晚期糖化终产物(advanced glycation end products, AGEs)与糖尿病主动脉重建密切相关［6，7］，但AGEs对VSMC的结构和功能，特别是表型有何影响，目前少有研究。为此，本实验拟观察糖尿病大鼠早期腹主动脉VSMC的超微结构、α-SM-肌动蛋白和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor-A, PDGF-A)的变化及其与AGEs的关系，研究VSMC在糖尿病早期结构和功能的改变，探讨糖尿病血管重建的机制。
材料和方法
1.动物模型的建立和分组
体重195±10g的雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)60只，随机分为对照组(C组，n=20)、糖尿病组(diabetes mellitus,DM组，n=20)和糖尿病盐酸氨基胍治疗组(aminoguanidine hydrochloride,AG组，n=20)。DM组和AG组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,美国Sigma公司)60mg/kg(临用前以0.1 mol/L，pH4.0枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制)，对照组注射相同缓冲液。48h后，取尾静脉血，One Touch Ⅱ血糖仪(美国Lifescan公司)测空腹血糖，以空腹血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型；AG组开始于饮水中给予非酶糖化抑制剂盐酸氨基胍(美国Sigma公司)100mg/(kg*d)。每周及实验前测空腹血糖，STZ注射后1、4、8、12周，每组各取5只进行检测。
2.取材和固定
1%戊巴比妥钠麻醉，颈总动脉插管，收集血液，肝素抗凝；每小组以3例灌注生理盐水和4%多聚甲醛，另外2例灌注生理盐水和2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，在左肾动脉起点下方切取腹主动脉，分别保存于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛。
3.血浆AGEs的测定
血液离心，取上清液0.2ml，蒸馏水稀释至2ml，Hitachi 850荧光分光光度计测定荧光值，激发光和发射光波长分别为370nm和440nm；考马斯亮蓝法测定稀释液的蛋白质浓度；用U／mg表示血浆AGEs水平。
4.腹主动脉的免疫组织化学观察
取4%多聚甲醛保存的标本，常规石蜡切片，片厚5μm。SP法显示腹主动脉的AGEs、α-SM-肌动蛋白和PDGF-A。兔抗AGE-HSA多克隆抗体(1∶200)为本室制备，即用型SP试剂盒和即用型兔抗鼠平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，兔抗人PDGF-A单克隆抗体(1∶150)购自美国Gene公司。用计算机图像分析系统计算动脉壁内α-SM-肌动蛋白阳性面积占视窗面积的百分比。AGEs和PDGF-A结果的判断是，基本无染色者为阴性，染色呈点状分布者为弱阳性，呈散在的片状分布者为中度阳性，呈连续的片状分布者为强阳性。
5.腹主动脉的显微结构
取石蜡切片进行HE染色，在光镜下用目镜网格测微尺计算腹主动脉平滑肌的细胞核密度，每例标本取3张切片，每张切片取动脉环的3、6、9、12点共4个视野进行观察。取2.5%戊二醛保存的标本，常规超薄切片，片厚50mm，醋酸铀和枸橡酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察VSMC的超微结构。
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