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小鼠树突状细胞肉瘤不同转移能力克隆的分离筛选鉴定 |
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涂布盖片，纯酒精固定后，热气流速干，置96孔板中，培养液洗涤后备用。实验时，6孔板内每孔加3ml培养液，10万个细胞，37℃，5%CO2孵箱温育60min，然后洗去未粘附细胞，更换新的培养板及培养液继续培养至24h。取出盖片，0.01mol/L pH7.4的PBS洗3次，2.5%戊二醛固定15min，考马斯亮蓝R250(Serva,NY)染色30min，漂洗、风干、树胶封片，光学显微镜下观察并摄片。
4.细胞蛋白水解能力结果判断
经染色后血浆基质为蓝色，肿瘤细胞可将其周围的蛋白基质水解，留下透明空斑区，该透明空斑的有无及大小即可反映肿瘤细胞的蛋白水解能力(图1)。将瘤细胞随机计数200个以上细胞，计数水解细胞的比例。
5.DCS细胞及克隆细胞体内肺转移能力的鉴定
分别收集DCS母系及克隆的细胞，制备细胞悬液，以2×106／0.2ml肿瘤细胞接种于近交系615小鼠右侧腋下，观察记录肿瘤生长情况。于22～23d全部处死。取引流淋巴结及肺、肾、肝、脾、脑组织，10%PBS福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、树胶封片，组织学观察。
肺内肿瘤组织学分级参照高进［4］分级法。
Ⅰ级：肺内查见1～5个小转移灶(直径<1 mm)。
Ⅱ级：肺内有6～10个小转移灶或1～2个中等转移灶(直径1～2 mm)。
Ⅲ级：肺内广泛分布小转移灶10个以上，或有大转移灶(直径>2 mm)。整个肺叶由转移瘤灶取代。
6.肿瘤组织中Laminin(LN)的免疫组织化学观察
瘤组织经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片。LN多抗系SIGMA公司产品(Lot 086H4822)，1∶20稀释。免疫组织化学染色采用SP法，DAB显色。
结 果
1.DCS克隆细胞的分离
采用极限分离法，一次获得18个单细胞克隆细胞株。经初步筛选选出具有代表性的克隆DD1、DG6、DF7和DF1。克隆细胞的形态较为一致，各有一定特点。DD1(图1)和DF7细胞长棱形，DG6(图2)和DF1圆形、短梭形细胞较多。
2.各克隆细胞株水解能力观察结果
表1 不同克隆细胞水解细胞百分比%
Table 1 The percentage of proteolytic
cells in different clones
克隆细胞株
clones 1 2 3 平均
average
DCS 3.62
- - -
DD1 14.90 15.31 17.21 15.80
DF1 5.50 - - -
DG6 5.30 7.07 3.78 5.39
DF7 19.80 - - -
DD1克隆细胞株中具蛋白水解能力的细胞比例较高。DG6克隆细胞中较低。单个DD1细胞的水解空斑(图3)也较单DG6细胞的水解空斑大(图4)。提示DD1细胞的水解作用较DG6细胞强。
3.各克隆细胞株体内肺转移能力测定结果
图1 DD1和图2 DG6细胞形态。 相差 ×100
Fig.1 The image of DD1 and Fig.2 DG6 cells. Phase contrast ×100
图3 DD1和图4DG6 在蛋白基质上蛋白水解活性图像。 ×100
Fig.3 The proteolysis of DD1 and Fig.4 DG6 on protein-coated coverslip. ×100
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