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人绒毛膜促性腺激素 亚基在大肠杆菌中的表达 |
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性，所以认为hCGβ亚基的研究具有真正的实用价值。
我们在以前的工作中采用新鲜的人绒毛膜组织，用异硫氰酸胍酚法抽提mRNA，经逆转录生成cDNA，用PCR方法对cDNA进行扩增，然后直接克隆至PCRⅡ载体中［3］。
本研究中，我们在hCGβ亚基cDNA克隆的基础上重新设计引物，用PCR方法扩增目的DNA，将其克隆到表达质粒PG5中，经序列分析证实为正确的目的DNA后，转化到表达菌BL21中，进行表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶及主要试剂 限制性内切酶NdeI、BamHI和T4DNA连接酶购自Promega公司，PCR试剂盒购自PE公司，低分子蛋白标准购自上海东风生物技术有限公司。
1.1.2 载体与菌株 PCRⅡ/hCGβ质粒，大肠杆菌表达载体PG5，受体菌E.coli DH5α，表达菌E.coli BL21均为本室保存。
1.1.3 PCR引物 上游引物5’-TGA ACA TAT GGA GAT GTT CAA GGG GCT-3’；下游引物5’-CTA TGG ATC CTA CCG TGC GAG GAT CGG GG-3’；由大连宝生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 hCGβ的PCR反应 用PCRⅡ/hCGβ质粒作为PCR反应的模板，每100 μl反应液中含KCl 50 mmol/L，Tris-Cl 10 mmol/L(pH8.3)，MgCl2 4 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物400 nmol/L，TaqDNA聚合酶2.5 U，在PE-TCI上进行扩增。95℃变性5 min后，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min共30个循环，最后72℃延伸5 min。
1.2.2 表达载体的构建 将PCR扩增回收的hCGβ基因片段和PG5载体，分别用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物用1.5%琼脂糖电泳分离，经透析袋回收，纯化后用T4DNA连接酶连接。
1.2.3 包涵体的纯化 rhCGβ主要存在于包涵体中。超声破碎离心后的沉淀依次用①1 mg溶菌酶，30 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，1 mmol/L EDTA，20%蔗糖，洗涤1次。②50 mmol/L乙酸钠(pH=5.0)，1 mmol/L EDTA，1%Tris X-100洗涤3次。③20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA，2%脱氧胆酸盐，室温20 min。④20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA洗涤1次。⑤8 mol/L尿素，50 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)溶解后纯度可达90%以上，再经Sephadex G-150过柱后，纯度可达95%以上。
2 结果
2.1 PCR扩增结果 经过30个循环的PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，PEGM3Z/HaeIII分子量标准显示在500 bp处有一条DNA带，与预期的长度相符。
2.2 重组表达质粒的酶切及序列分析 筛选克隆阳性的菌落，增菌并提取质粒DNA，用NdeI/BamHI双酶切和PCR扩增两种方法鉴定(图1)。hCGβ的序列分析在ABI PrismTM377全自动测序仪上进行，hCGβ的序列分析结果表明所克隆的基因序列与Genbank上的hCGβ序列完全一致。
2.3 rhCGβ在大肠杆菌中的表达 PG5/hCGβ重组质粒转化E.coli BL21的感受态细胞，挑选阳性菌落培养至600 nm波长的OD在0.4～0.6之间时，加0.5 mmol/L IPTG，继续培养4 h后，用12%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物［4］。染色后可见在18 kD左右有一条明显的新增蛋白带，与预期的分子量相符，激光密度扫描计算此蛋白质量约占菌体总蛋白的10%左右，未经IPTG诱导的阳性细菌并无此带(图2)。
2.4 表达产物的Western印迹鉴定 经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜，与DAKO公司兔抗人hCG多克隆抗体作Western印迹。结果证明rhCGβ的分子量约为18 kD，且为单一条带。说明与兔抗人hCG多克隆抗体有特异的反应(图3)。
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