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凋亡细胞体外抑制T细胞活化 |
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、转铁蛋白受体(CD71)和CD69，这些分子被称为活化标志［4］。CD69是已知的T细胞活化时表达最早的一个膜抗原，活化后1至2 h即可在细胞膜表面发现该分子的表达［5］。本实验以ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系为实验对象，T细胞表面CD69为观察指标，研究凋亡细胞对T细胞活化的影响，从而探讨凋亡细胞对免疫系统的作用。
1 材料与方法
1.1 动物 Balb/c纯系小鼠，雄性，6～8周龄，购自中山医科大学实验动物中心。
1.2 试剂 FTY720系日本福吉药厂生产，日本京都府立医科大学中岛启雄博士惠赠，放线菌酮(CHX)购自美国CALBIOCHEM公司，刀豆素A(ConA)美国SIGMA公司生产，RPMI1640和胎牛血清购自美国HYCLONE公司，AnnexinV-FLUOS试剂盒购自德国BOEHRINGER MANNHEIM，所用抗小鼠单隆抗体见表1。
1.3 药物诱导K562、HL-60细胞凋亡 K562、HL-60细胞在RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，5×10-5mol/L 2-ME，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)中进行传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。凋亡诱导时，于2×105 ml-1的K562或HL-60细胞中加入FTY720(终浓度50 μmol/L)或CHX(终浓度50 μmol/L)，CO2，37℃孵育14 h，PBS洗4次(300 g，5 min，4℃)，记数，备用。
1.4 凋亡细胞检测 0.4%台盼蓝侵染检测细胞膜完整性。106细胞PBS洗1遍，去上清后加入Annexin-V染液100 μl，15 min后荧光显微镜(Nikon)观察、拍照(530 nm滤光片)。发绿光荧光为Annexin-V阳性。与常光照片对照计算凋亡率。
1.5 K562细胞坏死 106 K562细胞悬于PBS溶液中，56℃水浴1 h，0.4%台盼蓝侵染检查细胞活率(侵染阳性率＞90%)，PBS洗1次，备用。
1.6 小鼠脾细胞活化 无菌条件下取Balb/c小鼠脾脏，碾磨后细胞悬于RPMI1640培养液(含20%胎牛血清，余同1.3)，100目尼龙网滤过。0.4%台盼蓝侵染检查细胞活率(＞98%)，3%乙酸溶液稀释记数。2×106脾细胞与凋亡(实验组)或活的、坏死的(对照组)细胞共同孵育2 h(5%CO2，37℃)后，加入ConA(10 μg/ml)，继续孵育6、20 h后分别取样检测。
1.7 淋巴细胞荧光抗体标记 三色直接荧光标记法：6×105脾细胞，PBS洗1次，去上清，加入anti-CD3-PE，anti-CD8-Cy-Chrome，anti-CD69-FITC各10 μl，室温孵育30 min，PBS洗1次，1%多聚甲醛固定10 min后流式细胞仪分析。
1.8 流式细胞仪数据获取及分析 全部数据用流式细胞仪(FACStarplus，美国BD公司)和软件LYSYSⅡ进行三色荧光参数获取及分析。简述如下：在前散射(FSC)和侧散射(SSC)的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区(R1)，然后对淋巴细胞作PE、FITC和Cy-Chrome荧光强度检测，其中荧光1(FL1)为FITC，滤光片带通为(530±10)nm，荧光2(FL2)为PE，滤光片带通为(575±10)nm，荧光3.1(FL3.1)为Cy-chrome，滤光片带通为(660±10)nm。先根据淋巴细胞PE荧光强度划出CD3+T细胞区(R2)，再检测T细胞FITC和Cy-Chrome荧光强度，数据显示于双色Dot-plot(FL1 vs FL3.1)图中。数据分析时，根据Isotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阳性、双阴性和单阳性区。
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