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蓖麻毒素诱导U937细胞分泌IL |
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1.3 蓖麻毒素对细胞因子的诱生 细胞培养上清的收集：以含10%的小牛血清、20 mmol/L HEPES的RPMI1640培养液，于37℃ CO2孵箱中培养U937细胞。将细胞分装于96孔培养板中，每孔细胞数为1×105个，每5孔为1组，分别加入1 pmol/L的ricin及其修饰物，于6、12、24和48 h收集培养上清。按不同浓度(0、1、10及100 pmol/L)的蓖麻毒素作用于U937细胞，24 h后收集细胞培养上清，于-80℃冻存备用。细胞因子的检测：按照kit的要求进行操作。数据整理和结果判断：以标准品的浓度为横座标，A值为纵座标，绘制标准曲线。根据标本的A值可从标准曲线上查出其浓度。每个标准品和标本的A值应减去空白对照的A值。
2 结果
2.1 蓖麻毒素对U937细胞的毒性 用ELISA于波长490 nm检测同一时间不同浓度的蓖麻素素与U937细胞作用的A值(见图1)，以及同一浓度、不同作用时间的蓖麻毒素与U937细胞作用的A值(见图2)。取每组5个数据的均数，进行统计学处理，两两比较，观察各组间相差是否显著。由结果可看出：随蓖麻毒素浓度的增加和作用时间的延长，对U937细胞的毒性也增加。
图1 不同浓度的蓖麻毒素与U937细胞作用24 h时的A值
Fig.1 A value of interaction of ricin in different concentration with U937 at 24 h
图2 1 pmol/L蓖麻毒素与U937细胞作用不同时间的A值
Fig.2 A value of interaction of ricin in 1 pmol/L with U937 at each time points
2.2 蓖麻毒素对U937细胞的诱生作用
2.2.1 蓖麻毒素作用不同时间对诱生IL-6和IL-8的影响 1 pmol/L的蓖麻毒素作用于U937细胞后，在不同时间点测定IL-6和IL-8的分泌量。由图3可看出，蓖麻毒素作用U937细胞后，分泌IL-8的量随作用时间的延长而逐渐增高；而蓖麻毒素诱生IL-6 的量则随时间的延长也逐渐增高，但增高的幅度很小。
2.2.2 不同剂量的蓖麻毒素对诱生IL-6和IL-8的影响 将不同浓度的蓖麻毒素作用于U937细胞24 h，检测U937细胞分泌IL-6和IL-8的量。图4显示，总的趋势IL-8的量较IL-6 的量要高。IL-6随蓖麻毒素浓度的增高变化不大，而IL-8随浓度的增高明显降低。
图3 蓖麻毒素作用不同时间对诱生细胞因子的影响
Fig.3 The effect of ricin inducing cytokine at each time points
Note:The concentration of ricin is 10-12mol/L;cytokine concentration of untreated cell is ajusted to zero at each time point
图4 不同浓度的蓖麻毒素诱生细胞因子作用
Fig.4 The effect of ricin inducing cytokine at different concentration
Note:The time of ricin interaction with U937 cell at 24 h
3 讨论
蓖麻毒素是由A、B两条肽链通过二硫键构成的糖蛋白。以往认为蓖麻毒素的中毒机理是由于蓖麻毒素分子中有半乳糖结合位点可非特异地与真核细胞膜表面的β-1，4-甙键半乳糖残基结合，而后A链穿过细胞膜，与核糖体60 S亚基结合而抑制蛋白质合成，导致细胞中毒死亡。但小鼠蓖麻毒素中毒后病理解剖观察各个组织脏器均出现不同程度的出血、炎症和坏死等症状［5］，这些现象用目前的中毒机理是不能完全解释的。本研究小组已经证实蓖麻毒素能够诱生TNF-α和IL-β的作用，又采用同样的方法检测了其作用于U937细胞后对IL-6和IL-8的诱生作用。研究结果表明蓖麻毒素对U937细胞的毒性具有时间依赖性和剂量依赖性，从MTT检测结果找出恰当的作用时间点和剂量点，较低剂量上一页 [1] [2] [3] 下一页
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