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人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达 |
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于美国Promega公司；Gene Clean Ⅱ试剂盒，由白求恩医科大学分子生物学教研室惠赠；纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)购于美国BIO 101公司；YEXpressTMYeast表达系统购自CLONTECH Laboratories，INC。流产胎儿脑组织由白求恩医科大学中日联谊医院妇产科提供。
1.2 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 取流产胎儿脑组织约0.2克，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经逆转录得到cDNA以此为模板，用FGF13特异性引物(5’端引物ATTAGAATTCATGGCGGCGGCTATCGCCAT；3’端引物ACAGGTCGACCTACGTTGATTCATTGTGGC)进行回收之后克隆入pCRTMⅡ质粒。用EcoR和SalⅠ双酶切pCRTMⅡ重组质粒，将释放出的特异性DNA片段次级克隆入pYEX4T-1质粒。用DNA测序仪对重组pYEX4T-1质粒内的外源基因进行序列测定。
1.3 hFGF13基因在酵母中表达 将重组pYEX4T-1-hFGF13质粒转染酵母细胞DY150，筛选阳性转化菌进行培养。当培养物的OD600值达到0.8～1.2时，加入5 μl 1 mol/L CuSO4进行诱导，诱导1 h后收集细胞。
1.4 表达产物的SDS-PAGE鉴定 550×g离心5 min以收集诱导的酵母细胞。弃上清，重悬细胞沉淀于1 ml冰预冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10 000 r/min 离心1 min。弃上清，向细胞沉淀中加入75 μl酵母裂解缓冲液(50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl，0.1% Triton-100，0.5% SDS)。剧烈震荡30 s，冰上放置1 min，重复5次。加入75μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5 min。10 000 r/min 离心1 min，将上清转移至另一管中，取适量进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后观察。
1.5 表达产物的Western-blot鉴定 通过电转移法将经过SDS-PAGE分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。以兔源抗谷胱甘肽转移酶(GST)的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗兔抗体为二抗，二氨基联苯胺为显色底物进行Western-blot分析［3］。
1.6 表达产物的粗提 收集经过诱导的酵母细胞，重悬于2 ml裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0；1 mmol/L EDTA；100 mmol/L NaCl；1 mmol/L PMSF)。超声破碎细胞2 min。10 000 r/min 离心2 min。将上清转移至透析袋内，置0.01 mol/L pH7.2的PBS溶液中透析24 h，后用蔗糖反透析2 h，再置生理盐水内透析24 h。
1.7 表达产物的活性测定 用含0.5%小牛血清的IMDM培养液在96孔板内培养NIH3T3细胞，每孔约5×104个细胞，37℃培养24 h。加入粗提的酵母表达产物100 μl，同时设立阴性对照、空白对照以及拮抗实验。分别采用MTT法和 3 H-TdR掺入法测定NIH3T3细胞的增殖情况。
2 结果
2.1 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 自流产胎儿脑组织提取总RNA，将其逆转录成cDNA。用2个hFGF13特异性引物做PCR。取PCR产物做2%琼脂糖凝胶电泳，放大的特异性cDNA片段大小约760 bp，与预期的片段长度相符(图1A)。将得到的特异性cDNA克隆入pCRTMⅡ质粒，EcoRⅠ酶切鉴定筛选阳性重组质粒。由于hFGF13 cDNA序列内含两个PstⅠ酶切点，因此用PstⅠ酶可将hFGF13 cDNA切割为251、322、165 bp 3个片段，据此可进一步鉴定此片段的正确性。经PstⅠ和EcoRⅠ酶切重组pCRTMⅡ质粒，在琼脂糖凝胶电泳显示有170、250、320 bp 3条区带，这与预测的一致，更证实了此片段的正确性。将此片段次级克隆入pYEX4T-1质粒，EcoR和SalⅠ双酶切鉴定筛选阳性重组质粒(图1B)。用DNA序列分析仪对重组pYEX4T-1质粒中的外源片段进行测序。结果表明，我们所获得的cDNA片段与已发表的FGF13cDNA的序列完全相符。
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