|
树突状细胞体外定向诱导扩增及其分离纯化 |
| |
备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。但DC在体内分布广泛且数量较少，因此如何获得大量的纯化的DC就成为进一步研究DC特性及功能的前提。为进一步研究树突状细胞的功能及特性，我们建立了利用脐血CD34+细胞诱导DC及其纯化的方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞来源 脐血样品采自解放军总医院，肝素抗凝终浓度为20 U/ml，平均采血量为50～80 ml，样品在采集24 h内分选，细胞经PBS缓冲液稀释，Ficoll(相对密度1.077)梯度离心，收集界面层单个核细胞(MNC)，洗涤备用。
1.2 CD34+细胞的分离纯化 如我们以往的报道，利用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS)进行分离，所用抗CD34抗体为QBEND-10，磁珠为羊抗鼠IgG1免疫磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)。标记细胞通过置于磁场中的分离柱，洗脱去除CD34-细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD34+细胞，每份脐血(50～80 ml)可分离纯化出(2.58±1.04)×106 CD34+细胞。流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)检测其纯度，标记抗体为FITC结合的抗HPCA-2(CD34)抗体8G12(BD公司)。
1.3 CD34+细胞体外诱导分化体系 IMDM(Gibco公司)培养基中含体积分数为12.5%的HS、12.5%的FCS、5×10-7mol/L氢化可的松、CD34+细胞5×103 ml-1及不同组合的重组细胞因子。上述体系接种于24孔板(Costar公司)中，每孔1 ml，复种5孔，37℃、体积分数为5%CO2空气条件下培养2 w，每2 d 加入细胞因子1次，共加5次，12 d后收获细胞用于细胞表面标志检测及纯化。
1.4 重组细胞因子及实验分组 细胞因子来源及浓度见表1。按4种细胞因子的组合分为6组：对照组(不加任何细胞因子)；SCF+GM-CSF；SCF+GM-CSF+IL-4；FL+GM-CSF+IL-4；SCF+GM-CSF+IL-4+TNF-α；FL+GM-CSF+IL-4+TNF-α。
1.5 细胞形态学分析 倒置显微镜(Olympus)下观察细胞并摄影。
1.6 树突状细胞的分离纯化 采用Immunotech公司的免疫磁珠分选系统，抗树突状细胞单克隆抗体为X-11(小鼠IgGl)，用此单克隆抗体与抗鼠IgG的免疫磁珠4℃孵育30 min，再加入到诱导后的细胞中，孵育30 min后，将试管放到带有强磁场的试管架(Immunotech公司)上，吸掉未吸附的细胞，将试管移开磁场，收获细胞，PBS缓冲液洗涤2次，用于检测CDla。
1.7 细胞表面的流式细胞仪分析 用于表面标志细胞检测的单克隆抗体为PE结合的鼠抗人CDla单抗、FITC结合的CD80(B71)单抗及PE结合的HLA-DR单抗(Pharmigen公司，深圳晶美)。抗体1：10稀释，与细胞4℃孵育20～25 min，PBS洗涤2次，重新悬浮，流式细胞仪检测，所用流式细胞仪为Coulter公司的ELITE型，分析软件为ELITE，每个样品分析细胞数≥5×104。
表1 细胞因子来源及终浓度
Tab.1 Sources and working concentration of different cytokines
Cytokines Source End concentration(ml-1)
SCF Sandoz Co. 100 ng
GM-CSF Glaxo Co. 40 ng
TNF-α Pepro Tech Co. 50 U
IL-4 Promega Co. 1 000 U
FL Immunex Co. 40 ng
1.8 统计学分析 采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 CD34+细胞向树突状细胞的定向诱导分化 DC表达CDla抗原，在SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4等细胞因子的诱导下，CD34+细胞可分化形成大量的DC(CDla+)。图1显示了不同细胞因子组合对DC生成的诱导效率，可见诱导培养2 w后，不含细胞因子的对照组，CDla+细胞仅占细胞总数的(0.65±0.38)%，而不同细胞因子的组合则可使CDla+细胞的比例增至(3.13±0.39)%～上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 应用ICS
下一个医学论文： 人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文