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利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 |
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ide法要求外周血中的嗜酸性粒细胞数至少为白细胞的2%，且易造成嗜酸性粒细胞的皱缩，而Percoll法更是要求嗜酸性粒细胞至少为外周血白细胞的4%，因此采用以上2种不连续的密度梯度离心法很难从正常人群中分离出大量的高纯度嗜酸性粒细胞。我们采用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞，获得较好的效果。
1 材料与方法
1.1 试剂 磁性微球，武汉工业大学与本校免疫教研室共同研制，球形，表面功能基团为羧基；鼠抗人CD16单克隆抗体，北京邦定生物医学公司生产，与人中性粒细胞表面CD16特异结合；Percoll贮存液，Pharmacia公司生产，密度1.13±0.001，根据有关文献配成密度为1.083的Percoll应用液［3，4］；乙醇胺，郑州市化学试剂三厂生产，用以封闭磁性微球余下的活性基团；SPA(葡萄球菌A蛋白)，上海生物制品研究所生产，与单克隆抗体Fc段有强结合力；FCS(胎牛血清)，中德三利生物制品厂生产；异硫氰基荧光黄(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体，上海生物制品研究所生产。
1.2 器材 自制MACS(Magnetic Activated Cell Sorter，磁性细胞分选仪)，由武汉冶金研究所与本科共同研制，主要由永久磁场(磁场强度为0.54特斯拉)和分离柱组成，分离柱内含不锈钢丝绒，提供细胞停留的表面及强磁场，便于细胞的分离；低温冷冻离心机：美国贝克曼公司生产；CELL-DYN3500血细胞计数仪：美国雅培公司生产；荧光显微镜：日本奥林巴斯公司生产。
1.3 标本 健康献血者28例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.05×109～0.40×109) L-1。哮喘等各种变态反应性疾病病人21例，外周血嗜酸性粒细胞计数(0.5×109～1.78×109) L-1。
1.4 方法
1.4.1 磁性微球的标记 空白磁性微球悬液，加入等体积的SPA溶液，4℃过夜孵育，不断振摇，用磁场收集磁性微球，加5倍体积乙醇胺溶液(1 mol/L、pH=8.0)，室温放置1 h，不断振摇，用以封闭磁性微球余下的活性基团。然后用PBS洗涤，加入鼠抗人CD16单克隆抗体，4℃孵育1 h，PBS洗涤，然后配成一定浓度的鼠抗人CD16单克隆抗体标记的免疫磁性微球(Immunomagnetic Microbeads，IMB)，4℃无菌保存。
1.4.2 外周血粒细胞的分离 静脉血20 ml，肝素钠抗凝，用CELL-DYN3500血细胞计数仪进行细胞分类计数，PBS对倍稀释，置于20 ml的Percoll应用液上，1000 g离心30 min，保留红细胞、粒细胞层。加入5倍体积冰冷的155 mmol/L NH4Cl溶液，0℃冰浴15 min，用冰冷的PBS(含2%FCS)洗涤粒细胞2次，4℃离心7 min(400 g)，保留10 μl沉淀，加入90 μl冰冷的PBS(含2%FCS)，冰浴保存。
1.4.3 嗜酸性粒细胞的分离 将免疫磁性微球与已分离的粒细胞悬液混合(免疫磁性微球数∶细胞总数=20∶1)，4℃孵育1 h。然后加入冰冷的PBS 4 ml(含2%FCS)，并将液体转移至自制MACS的分离柱，用50 ml的刻度试管收集过柱液，再次加入冰冷的PBS 32 ml(含2%FCS)，收集过柱液，400 g离心7 min，用CELL-DYN3500血细胞计数仪对嗜酸性粒细胞进行计数，并进行瑞氏染色和台盼蓝染色，计算分离的嗜酸性粒细胞的纯度、存活率与回收率。
1.4.4 残留CD16+的细胞的检测 将分离后的细胞用PBS(含2%FCS)悬浮，使细胞浓度2×106 ml-1，取100 μl的细胞悬液于试管中，加入20 μl的鼠抗人CD16单克隆抗体，混匀后4℃孵育1 h，然后用PBS(含2%FCS)洗涤3次，4℃离心7 min(400 g)，保留约50 μl液体，再加入20 μl的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，混匀后孵育、洗涤、离心(条件同前)，保留少许液体于试管中，混匀，吸一滴于玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜计数产生特异性荧光的细胞，并用普通光源计数细胞总数，计算两者的比率(即为残留的CD16＋的细胞比率)。
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