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野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备 |
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DU145细胞1.5×106在100×15 mm的塑料平皿中过夜培养，粘附于平皿上。3 ml IMDM冲洗然后加入6 ml IMDM含有lipofectamine 1.67 μg/ml 37℃ 5%CO2孵育6 h。对照组同样方法转染pCMV空载体转染后细胞在400 μg/ml Geneticin 中培养以筛选出阳性克隆［2］。
1.6 p53基因表达产物的检测 p53基因产物的表达选用Do-7单克隆抗体(美国DAKO公司产品)和HRP标记羊抗鼠IgG，常规方法染色。
2 结果
RT-PCR反应后在有wtp53转染的DU145细胞中有一特异性的PCR产物，长度为1 124 bp，说明转染DU145细胞后，wtp53仍稳定地存在于wtp53重组体中。免疫组化可见胞浆中有wtp53基因产物，而对照组则没有。说明p53可稳定地表达于DU145细胞中。
3 讨论
p53基因定位于人类17号染色体短臂1区内，全长约20 kb，由11个外显子和10个内含子组成［3］。p53基因转录产生约2 kb mRNA，编码一个393个氨基酸的蛋白，分子量为53 kD［4］，本研究用RT-PCR技术将p53基因起始密码子与终止密码子之间cDNA序列扩增出来，重组到真核表达载体pCMV中，并在DU145细胞中得到了稳定表达。
目前用于转染外源基因的真核表达载体主要包括逆转录病毒载体，腺病毒载体和脂质体载体。一个有效的基因转移载体主要特征是：①靶细胞的特异性，即载体只作用于某一特定细胞；②转染的高效性；③基因表达的持续性；④载体的安全性；⑤生产过程和使用的简单性；⑥费用低廉。与其它两种载体相比，脂质体载体具有第一条以外的全部优点，且这一缺陷可通过基因疫苗在体内的局部注射而得以弥补。
p53基因为抑癌基因，已有研究表明，携带有野生型p53基因的腺病毒载体，可抑制前列腺癌Tsu-Pr1、PCm-3、C4-3、DU145等细胞系的生长，并诱导其调亡，而体内研究表明，p53可以有效地抑制在裸鼠中C4-2前列腺癌的生长和PSA的产生［5］。本研究所制备的野生型p53基因脂质体转染的核酸疫苗，较之已有的表达系统有一定的优势，为前列腺癌的基因治疗打下了基础。
(编辑 张 慧)
本课题受吉林省卫生厅科研基金资助
作者简介：孔祥波，男，48岁，教授，主要从事泌尿系统肿瘤研究工作
孔祥波（白求恩医科大学第三临床医学院泌尿外科，长春 130021）
谷新权（白求恩医科大学第三临床医学院泌尿外科，长春 130021）
马庆杰（白求恩医科大学第三临床医学院核医学科，长春 130021）
4 参考文献
［1］Michalovity，Halevy O，Oren M et al. p53 mutotion:gains or losses? J Cell Biochem，1991;45:22
［2］Janice DeMoor， Mark Vincent，Olga Collins.Antisense nucleic acids targeted to the thymidylate synthase(TS) mRNA translation start site stimulate TS cebe transcription. Experimental Cell Research，1998;243:11
［3］Lamb P，Crawford L.Characterixation of the human p53 gene.Mol Cell Biol，1986;6:1379
［4］Levine A J，Momand J，Finlay C A et al. The p53 tumor suppressor gene.Nature，1991;351:453
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