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野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备 |
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孔祥波 谷新权 马庆杰
摘 要 目的：制备具有治疗活性的野生型p53基因真核表达载体的细胞疫苗。方法：利用RT-PCR从人外周血淋巴细胞总mRNA中扩增出全长的野生型p53基因，将其克隆入TA克隆载体，经扩增后，将p53cDNA连入pCMV真核表达载体中。利用lipofectamine将其转染DU145细胞并通过免疫组化的方法检测其表达情况。结果：p53基因可在DU145细胞中稳定表达。结论：制备了可稳定表达于DU145细胞中的野生型p53基因细胞疫苗。
关键词 野生型p53基因 DU145 核酸疫苗
中国图书分类号 R737.25 R730.43
Construction of wide-type p53 gene vaccine
KONG Xiang-Bo，GU Xin-Quan，MA Qing-Jie.
The Third Clinical College，Norman Bethune University of Medical Sciences，Changchun 130031
Abstract Objective:To construct a wide-type p53 gene vaccine which has the therapeutic activity.Methods:We get the intact wide-type p53 gene from human peripheral lymphocyte total mRNA using RT-PCR，then cloned it to TA vector and link to pCMV after gene amplification.pCMV-p53 expression vectors were transfected in DU145 using lipofectamine and the protein was detected by immunohistochemistry.Results:p53 gene can express stability in DU145.Conclusion:We constructed a p53 gene vaccine what can express stability in Du145 cell line.
Key words Wide-type p53 gene DU145 Gene vaccine
近年来，人们对p53基因在肿瘤发生和发展方面的作用产生了浓厚兴趣。经过大量研究，现在认为野生型p53基因在正常条件下能抑制细胞生长和促进分化，当该基因发生突变缺失时，这种抑制功能即丢失，使细胞易向恶性转化。还有证据表明，突变的p53具有直接致癌作用［1］。在正常细胞中p53基因表达较少，而在肿瘤细胞中，往往具有高度表达的突变型的p53。因此本研究拟构建一个可表达于前列腺癌细胞系内的野生型p53基因疫苗，为前列腺癌的基因治疗打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料 Trizol mRNA提取试剂盒，TA克隆载体，pCMV真核表达载体，lipofectamine美国Gibco公司。DU145人前列腺癌细胞系由美国Florida大学Hobeika-AC博士惠赠，T7聚合酶DNA测序试剂盒，美国Promega公司。
1.2 人外周血淋巴细胞总mRNA提取 利用Trizol mRNA提取试剂盒，按操作手册进行。
1.3 RT-PCR扩增p53基因的cDNA 上游引物序列为：5’-GCTTCTGACCTACTGACG-3’；下游引物序列为：5’-CCCGGACAGAGTCTGACT-3’。扩增长度为1 184 bp。RT-PCR反应条件为：1×PCR标准缓冲液，0.2 mm/L dNTP，上下游引物各50 pmol/L，2单位逆转录酶。反应在50 μl体积中进行。循环温度设计为94℃1 min，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共进行45个循环。
1.3 按TA克隆及DNA序列测定 DNA序列测定 按TA克隆及T7聚合酶试剂盒说明书进行。
1.4 pCMV-p53真核表达载体的构建 TA克隆扩增后，利用EcoRI和BamHI双酶切将p53cDNA切下，克隆入pCMV真核表达载体中，利用酶切鉴定连接的正确性。
1.5 转染[1] [2] 下一页
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