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髓磷脂碱性蛋白促进单个核细胞对内皮细胞的粘附效应 |
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的发病机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 MBP 从牛的脑脊髓中提取，通过反复去脂，抽洗，酸抽提，高速离心等步骤，得到电泳为一条主带的MBP。
1.1.2 试剂 胰蛋白酶(上海Songon公司产品)，IMDM培养基(Takaro公司产品)，小鼠抗人CD45，ICAM-1(冯彪博士后惠赠)，sVCAM-1(Dr.Roy Lobb 惠赠)，小鼠抗人VCAM-1(迈新公司)。
1.1.3 脐带 剖宫产健康新生儿脐带，取自长春市妇产医院。
1.2 方法
1.2.1 HUVEC的培养 见参考文献［1］，在无菌条件下，取健康新生儿的脐带20～30 cm，用Hank s液反复冲洗至无血迹，灌入0.25%的胰酶，置37℃温箱中孵育15～20 min，倒出消化液，用含20%小牛血清的IMDM培养液冲洗，消化液与培养液置于离心管，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入培养液调细胞浓度5×105/ml，置96孔板培养2～3 d至融合。
1.2.2 MBP刺激的外周血单个核细胞(PBMNC) 无菌取健康人外周血，用Ficoll淋巴细胞分层液分离得到PBMNC，调细胞浓度为1×107，分为加MBP组(MBP终浓度为50 μg/ml)和对照组(不加MBP)。
1.2.3 粘附活性的测定［2，3］ 培养的HUVEC在96孔板长成致密单层后，分为两组，一组加入MBP刺激的分离的PBMNC的24 h的培养上清，另一组为对照。5%CO2孵箱培养6 h，倾去培养液，用IMDM培养液洗涤2次后，在孔中加入MBP刺激培养72 h和正常培养72 h PBMNC，2×105/孔，设3复孔，37℃孵育1 h，用温Hank s洗去未粘附PBMNC。用含0.15%EDTA与0.05%胰酶的IMDM 100 μl 37℃孵育20 min，洗去粘附的淋巴细胞，加至另一96孔培养板，进行记数，每孔加100 μl 37℃含20%小牛血清的IMDM和10 μl(5 mg/ml)MTT，37℃5%CO2孵箱培养6 h，于每孔加入100 μl SDS-甲酰胺溶液，室温放置1 h，测OD570nm值，用570nm值衡量粘附细胞的量。
1.2.4 可溶性粘附分子及抗粘附分子抗体对粘附的影响 HUVEC细胞长成致密单层后，加入MBP刺激PBMNC的培养上清，孵育6 h，一组加入CD54抗体(1：60稀释)，另一组作为对照。同时，将经MBP刺激的PBMNC分为：对照组，加入sVCAM-1(5 ng/ml)组，加入抗CD45(1：10稀释)组，孵育30 min。然后按下列情况进行粘附性实验：(1)HUVEC+PBMNC；(2)抗CD54-HUVEC+PBMNC；(3)HUVEC+抗CD45-PBMNC；(4)HUVEC+sVCAM-1-PBMNC。37℃ 5%CO2孵箱中孵育1 h，同上洗涤未粘附的细胞，测定OD570nm值。
1.2.5 TNF活性的测定 收集MBP刺激的PBMNC 24，48，72 h的培养上清，用L929细胞毒活性法进行测定，参见文献［4］。分别测定1：1，1：20稀释的24 h，48 h，72 h的培养上清［细胞毒性(%)＝(1-实验孔OD570nm/对照孔OD570nm)×100%］。
1.2.6 HUVEC的VCAM-1的表达 将MBP刺激的PBMNC的24 h培养上清加至刚刚融合的原代培养的HUVEC，每孔200 μl，阳性对照用100 U/ml的TNF，阴 性对照仅加培养液，继续培养48 h，4.4%枸橼酸钠消化液进行消化，Cytospin甩片机400 r/min甩5 min，经丙酮固定后，进行细胞免疫化学染色。
1.2.7 HUVEC的ICAM-1的表达 同上制备细胞，使每组含HUVEC5×105，加入FITC标记的小鼠抗人ICAM-1单抗，4℃孵育1 h，洗涤后，FCM检测，记数10 000个细胞。
2 结果
2.1 粘附活性测定 由图1可见，MBP刺激的PBMNC与HUVEC之间的粘附的细胞数较对照无显著性差异(P＞0.2)，PBMNC与加入MBP刺激PBMNC培养上清的HUVEC之间的粘附的细胞数与对照相比有差异(P＜0.05)，MBP刺激的PBMNC与加入MBP刺激PBMNC培养上清的HUVEC之间的粘附的细胞数与对照相比有明显差异(P＜0.01)。
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