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茶多酚的离体抗氧化作用 |
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o γ射线照射，样品距源中心线60 cm，高120 cm，照射剂量率为16.67 Gy/min，照射剂量为100 Gy。
2.溶血试验：人血RBC用生理盐水(NS)洗涤后，作1:90稀释，分组见表1,每组重复6管。加样后用30W紫外灯照射25min，然后置4℃ 24 h，离心取上清，用722分光光度计于540 nm测吸光值(A)。
3.质粒PUC19 DNA断裂试验：取0.67 μg/μL粒2 μL，加入一定量的茶多酚，加入TE缓冲液（pH7.4），使终体积为32 μL，分组见表2。60Co γ射线100 Gy照射后，置4℃ 8h，用0.8％琼脂糖电泳（电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳70V 3h），后用溴乙锭（EB）染色15 min。采用凝胶图像扫描系统扫描电泳结果，求出各孔超螺旋、开环型质粒所占的百分率。以λ DNA/HindⅢ Markers作为标准分子量对照物，以检测各条电泳带的DNA分子大小及构象。
4.肝匀浆GSH耗竭与测定：小鼠脱颈椎致死，立即取出肝组织，以4℃生理盐水作5％(W/V)组织匀浆，取2 mL肝匀浆，加入一定量的茶多酚(TP)及生理盐水(NS)，见表3，每组重复7管。加入1 mmol/L VitC和50 μmol/L FeSO4各0.2 mL，37℃水浴孵育60 min，激发氧自由基致GSH耗竭［5］。后用2 mL 10％TCA沉淀蛋白，离心取上清0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)2 mL及0.04％DTNB显色剂0.3 mL，混匀5 min后用722型分光光度计412 nm处测吸光值(A)。
以1 mmol/L GSH用同法作标准曲线，将上述吸光值代入GSH标准曲线回归方程，求得组织GSH含量，单位以μmol/g湿重表示。
各项数据用平均数和标准差()表示，t检验判定两组间差异的显著性。
结果
(一)溶血试验：结果见表1。
表1 TP拮抗UV致人血RBC溶血作用
Tab 1 Effect of TP on hemolysis degree induced by UV
TP n Absorbance
()
0 6 0.550±0.037
1.67 mg.mL-1 6 0.019±0.007*
3.33 mg.mL-1 6 0.011±0.002*
*P＜0.01, vs 0 group
实验得出，UV可致人血RBC溶血，茶多酚显著抑制UV致血RBC溶血作用，与对照组相比，差异十分显著(P＜0.01)。
(二)质粒PUC19DNA单链断裂测定：质粒PUC19是双链环状DNA，2 686 bp。双链环状DNA常呈超螺旋构象，若DNA单链断裂则转变为开环型质粒，若双链断裂则转变为线型质粒。60Co γ射线照射可导致DNA链断裂。实验证明，低剂量(10～180 Gy)γ射线照射，导致部分DNA单链断裂，呈超螺旋和开环型质粒，未发现线型质粒；高剂量(例400 Gy)照射，则导致DNA双链断裂，全部转变为线型质粒。本实验采用100 Gy γ射线照射，部分超螺旋DNA由于单链断裂而转变为开环型，茶多酚抑制了受照开环型质粒百分率的升高，即抑制了受照质粒DNA单链断裂作用,与照射对照组相比,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，结果见表2、图1。
表2 60Co γ射线致质粒PUC19 DNA单链断裂的测定
Tab 2 Test of single-strain break of plasmid PUC19
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