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玉米花粉多糖对大鼠肺泡巨噬细胞的激活作用 |
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醇各洗1次，丙酮、乙醚各洗2次后，挥干即得PPM。
二、实验动物：
正常SD大鼠(由本院实验动物中心提供)，体重250～300 g。
三、PPM细胞培养液的配制：
称取PPM 1.0 g，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液80 mL溶解，用5% NaCO3调节pH至7.2后定容至100 mL，0.22 μm微孔滤膜无菌过滤，配成10 mg/mL的PPM RPMI 1640细胞培养液，4℃冰箱保存。实验时再用无菌的RPMI 1640细胞培养液(pH7.2)稀释成250 μg/mL， PPM、 500 μg/mL PPM、 1 000 μg/mL PPM的RPMI 1640细胞培养液。
四、大鼠肺泡巨噬细胞的收集与培养：
取正常SD大鼠10只，股动脉放血处死后，常规消毒后于无菌室内用无菌的生理盐水20 mL通过气管插管灌入肺内，轻轻按柔肺部后抽回，重复灌洗1次，合并后于1000 r/min离心10 min收集细胞，用Hanks液洗涤后，用含10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养液调节成AMΦ浓度为2×106/mL，并以每孔0.5 mL分装在24孔细胞培养板上，在37℃、5%CO2浓度的条件下培养2 h，弃去细胞培养液及非贴壁的细胞，用Hanks液轻洗贴壁的AMΦ后，将AMΦ分成4组，每组8孔，分别加入RPMI 1640、 250 μg/mL PPM-RPMI 1640、 500 μg/mL PPM-RPMI 1640、 1000 μg/mL PPM-RPMI 1640细胞培养液2 mL在37℃、5%CO2条件下培养，并于24 h、 48 h时更换新鲜的培养液，72 h后弃去培养液，并用Hanks液轻洗AMΦ。
五、肺泡巨噬细胞的破碎：
取上述培养的 AMΦ，每孔加0.2 mL双蒸水，超声清洗机振荡2次，每次2 min，再用-30 ℃、+30 ℃反复冻融5次破碎细胞，制成每毫升为5×106个细胞的破碎AMΦ悬液。
六、AMΦ内LDH活性测定：
采用Wahlefeld方法，以L-乳酸为底物全自动生化分析仪上速率法测定NADH+H+的生成(全自动生化分析仪由日本日立公司制造，型号7170)，反应体系为：温度37℃，破碎的AMΦ悬液18 μL，延迟时间30 s，反应总体积360 μL，每隔15 s测1点，共测34点，以19～24连续6点直线回归求值。酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液37℃每分钟使1 μmol乳酸转化为丙酮酸所需的酶量为1IU。
七、AMΦ内ACP活性测定：
以对硝基苯酚磷酸酯为底物全自动生化分析仪(日立7170)双试剂终点法测定，R1为基质液(对硝基苯酚磷酸酯-柠檬酸buf，pH5.0)，R4为1 mol/L NaOH, λ1 405 nm,λ2 546 nm，反应体系为：破碎的AMΦ悬液10 μL，R1 200 μL, 反应100 min(测定34点)后加R4 100 μL终止反应求值，酶活力单位采用国际单位(IU)，即每升破碎的AMΦ悬液在pH5.0 、37℃、每分钟水解1 μmol对硝基苯酚磷酸酯为对硝基酚所需的酶量为1IU。
八、AMΦ内TNF含量测定：
用放射免疫分析法测定，试剂购自解放军总医院东亚免疫技术研究所，操作按说明书。
九、统计分析：
数据用表示，用t检验判定组间的差异显著性。
结果
一、PPM对AMΦ内LDH和ACP活性的影响：
表1所示，大鼠AMΦ经3种不同浓度的PPM 72 h诱导培养后，其细胞内LDH和ACP活性均非常显著地高于对照组(P＜0.001)，其中LDH活性具有明显的量效关系，随着PPM浓度的增大AMΦ内LDH活性显著降低。
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