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大鼠主动脉内膜球囊剥脱后再生内皮细胞表型改变的研究 |
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增殖仍处于活跃状态［2］，因此有理由推测再生内皮细胞存在功能不足或紊乱从而不能有效地抑制平滑肌细胞增殖。为验证这一假说，本实验验用大鼠主动脉内膜球囊剥脱的模型，观察再生内皮细胞的形态和功能的改变，以探讨再生的内皮细胞表型改变在再狭窄和动脉粥样硬化等病理发生发展中的意义，为这些病变的临床防治提供理论依据。
材料与方法
1.材料：大鼠由本校实验动物中心提供：［3H］-L-Arginie系英国Amersha International Pic.产品；去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach)、Dowex AG-50等购自Sigma公司。液闪仪为FJ-2107型。
2.大鼠主动脉内膜剥脱术［3］：选280～350 g雄性Wistar大鼠随机分为3组，即剥脱2周组、剥脱6周组和假手术组。剥脱组动物用0.6%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，暴露分离左颈总动脉，并插入自制2F球囊导管至腹主动脉，注入0.1 mL生理盐水扩张球囊后缓慢外拉以剥脱内膜，反复牵拉3次。缝合伤口后置于静室饲养。
3.主动脉组织学观察：取大鼠主动脉中段(经横隔处)约3 mm长，置于10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色后，在显微镜下观察血管内膜、中膜及细胞形态。
4.主动脉血管反应性测定［4］：取大鼠主动脉中段，去除周围脂肪组织后剪成3 mm长的血管环，置于盛有Krebs-Henseleit(K-H)液、37℃、95% O2和5% CO2平衡的浴槽中，通过张力传感器连接记录仪以记录张力变化。平衡60 min，每20 min换液一次。用10-6mol/L的NE预激2次，直到引起等张收缩，重调静息张力为2.0 g，依次做(1)NE10-9～10-5mol/L累积浓度收缩曲线，以产生最大的张力Tmax和ED50表示血管收缩性；(2)用硝普钠(SNP)10-9～10-5mol/L记录血管舒张反应性；(3)10-7～10-5mol/L的Ach记录血管的内皮依赖性舒张反应。
5.血管孵育液中［］检测和血管组织NOS活性测定：取主动脉去除周围组织后置于RPMI 1640培养液(含10% FBS)中孵育24 h，按Green等［5］的方法稍有改良测定血管孵育液中NO2-含量，以反映血管释放NO的量。血管组织NOS活性的测定按Scott等［6］的方法有所改良，根据1 mol精氨酸在NOS作用下生成NO的同时产生1 mol瓜氨酸，应用液体闪烁仪测定［3H］标记的精氨酸生成［3H］标记的瓜氨酸的量来表示NOS的活性。
6.统计学处理：所有数据以均数±标准差()表示，组间比较用t检验。
结果
1.组织学观察：正常血管横切面可见内膜、中层和外膜，其中内膜由一层内皮细胞所组成。剥脱后2周可见内膜层明显增厚，内皮细胞有多层，排列不整，细胞呈较细长的梭形或菱形；内膜下的基层破坏，中层平滑肌明显增厚，并有平滑肌细胞向内膜下迁移形成新内膜(neointima)，剥脱6周后的病变与剥脱2周组相类似。
2.血管内皮依赖性舒张反应变化：与正常血管相比较，剥脱组的血管舒张反应性明显减弱。剥脱2周组血管内皮依赖性舒张反应降低了78.9%(18.0%±4.4% vs 85.5%±6.5%，P＜0.01)，剥脱6周组血管内皮依赖性舒张反应降低了71.6%(24.3%±6.8% vs 85.5%±6.5%，P＜0.01)。剥脱2周组与剥脱6周组之间比较无显著差异。
3.血管孵育液中亚硝酸盐()的含量和血管组织NOS活性变化：测定血管组织孵育24 h后孵育液中的含量以反映血管组织释放NO的量。剥脱2周组比正常组降低63.4%(0.817±0.139 vs2.232±0.481 μmool/L，P＜0.01)；剥脱6周组比剥脱2周组有所增加(1.502±0.286 vs 0.817±0.139 μmol/L，P＜0.05)，但仍明显低于正常(1.502±0.286 vs 2.232±0.481 μmol/L，P＜0.01)，如表1所示。剥脱2周组血管组织iNOS和cNOS活性均明显低于正常；剥脱6周组的iNOS和cNOS活性也明显低于正常；但剥脱2周组和剥脱6周组之间比较，2周组的iNOS活性低于6周组，但cNOS活性无明显差别，结果见表2所示。
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