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携带黄矮病抗性基因染色体DNA文库的构建 |
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何聪芬 马有志 辛志勇 徐琼芳 李连城
分类号： Q813.4 文献标识码： A
文章编号： 0253－9772(2000)03－0161－01
Construction of the DNA Library of the Single Chromosome with
BYDV Resistance Gene
HE Cong-fen
（Institute of Crop Breeding and Cultune,CAAS ,Beijing 10008）（Biology Department,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050016,China）
MA You-zhi XIN Zhi-yong,XU Qiong-fang,LI Lian-cheng
（Institute of Crop Breeding and Cultune,CAAS ,Beijing 10008）
单条染色体的分离及其DNA片段的克隆是将细胞学与现代分子生物学相结合的一项新技术。它对染色体结构和基因进化的研究、基因组物理图谱及分子标记连锁图构建等，特别是增加染色体某些区域的探针密度具有重要意义。20世纪90年代以来，有关植物染色体微分离及体外扩增的报道中，只有少数几篇是关于单条染色体的体外扩增及其克隆，其采用的为微细玻璃针法。在前人工作的基础上，我们探索了一套操作方便、容易掌握的激光微分离、微克隆技术体系。
本文以中间偃麦草二体异附加系Z2与普通小麦宛7107杂交(Z2×宛7107)的F1为材料，利用激光微切割技术分离并回收了携带黄矮病抗性基因的中间偃麦草染色体2Ai－2(目标染色体)，进行了体外扩增和DNA文库的构建及特征分析，筛选到1个中间偃麦草特异性重复序列，2个寡拷贝中间偃麦草多态性探针，1个寡拷贝中间偃麦草特异性探针，1个单拷贝探针。对筛选到的中间偃麦草特异性重复序列进行了染色体原位杂交分析，为进一步筛选与黄矮病抗性基因紧密连锁的分子标记奠定了基础。初步建立了一套操作方便、容易掌握的植物染色体激光微切割技术体系。结果如下：
1.用激光消除法微分离了植物花粉母细胞中的特定染色体。取镜检合适的花药，短时间固定(15分钟)，轻度酶解，在无菌条件下，于特殊培养皿中涂片，在紫外激光共聚焦扫描系统的倒置显微镜下，利用氩离子激光，采用消除法，分离并回收了小麦遗传背景下携带黄矮病抗性基因的中间偃麦草染色体2Ai-2。随后的实验结果表明，这种制片方法适于植物花粉母细胞中染色体的激光微分离。
2.将分离的单条目标染色体放入0.5ml装有蛋白酶K的Eppendorf管中，经酶解及Sau3AI酶切后，在染色体DNA的两端加上Sau3AI的人工接头，经两次PCR扩增，得到150～3000bp的扩增片段。Southern杂交结果表明，这些染色体DNA片段与中间偃麦草基因组DNA之间有同源性，从而证明成功地扩增了分离的目标染色体。PCR扩增产物的染色体原位杂交结果不仅再次验证了扩增产物的可靠性，也表明了小麦与其近缘属种间的重复序列是相似的。
3.构建了目标染色体的DNA文库。文库中大约含有5×105个重组子。以中间偃麦草基因组DNA为探针的菌落原位杂交的结果表明，若不考虑重复，文库中约有3.14×105个与中间偃麦草有关的克隆；随机分析500个克隆的结果表明，文库中的插入片段在200～1500bp，平均为580bp；由于采取了防止高频率重复序列出现的措施(使用对胞嘧啶甲基化敏感的限制性内切酶Sau3AI)，文库中低拷贝克隆56％，重复序列占44％。
4.分别以中间偃麦草和中国春基因组DNA为探针，与转移到Hybonb-N＋尼龙膜上的插入片段进行Southern杂交，从500个克隆中初步筛选到55个中间偃麦草特异性克隆。
5.为了进一步证实行筛选到的55个克隆是否具有中间偃麦草2Ai－2染色体特异性，分别以其中的30个低拷贝和5个重复序列为探针，与经过限制性内切酶消化的中间偃麦草其及衍生物和宛7107等杂交。从30个低拷贝的克隆中筛选到2个中间偃麦草染色体多态性探针MAg088、MAg139，1个中间偃麦草染色体特异性克隆MAg065，一个单拷贝探针MAg381。从5个重复序列中筛选到1个中间偃麦草染色体特异性克隆MAg104，证实扩增产物仅来自目标染色体。
6.利用筛选的特异性重复序列作探[1] [2] 下一页
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