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血液透析患者丙型肝炎病毒高变区核苷酸序列分析 |
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女8例，平均年龄为47.3(34～70)岁，血透时间最短6个月，最长96个月，平均透析时间为36.8个月。血透前均无肝炎史，乙型和甲型肝炎病毒感染标志均阴性，透后3个月～3年出现ALT增高，乙型和甲型肝炎标志物多次阴性，其中5例透析时间在2年内者透前抗-HCV阴性。本中心每月常规检测肝功能、肾功能、血常规和血气分析，每3个月检测乙型和甲型肝炎标志物，1994年4月后常规检测抗-HCV。此15例患者均经ELISA法和RT-PCR法检测证实抗-HCV和HCV RNA阳性，方法见文献［5］。
二、核苷酸序列测定
1.引物：引物由中科院上海细胞研究所合成。SE1:5′-CTACTCCGGATCCCACAAGC-3′(相应于HCV J株1 338～1 357位），ASE1:5′-GGGCTCGGAGTGAAGCAATA-3′(相应于HCV J株1 848～1 867位），SE2:5′-ATTCCATGGTGGGGAACTGG-3′(相应于HCV J株1 414～1 433位），ASE2:5′-GCAATACACTGGACCACACA-3′(相应于HCV J株1 883～1 852位)。
2.RT-Nested-PCR检测：由SE1、ASE1引导进行第1轮扩增，SE2、ASE2引导进行第2轮扩增。取第2轮PCR产物20 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果［5］。
3.序列分析：第2轮PCR扩增产物经琼脂糖超纯胶电泳纯化后作为测序模板，以SE2或ASE2末端标记同位素（γ-32P)作为测序引物，使用双链DNA循环测序盒（GIBCO BRL公司产品）进行序列分析［6］。
结果
一、15例血透患者感染HCV分离株HCV RNA HVR（E2/NS1区）扩增产物的核苷酸序列测定结果见图1。
图1 15例血透患者HCV分离株E2/NS1区部分核苷酸序列(1 479～1 559为高变区)
二、15例血透患者相互间HCV分离株HVR核苷酸序列的同源性比较：
由表1可见，各分离株间HCV RNA HVR核苷酸序列同源性57.50%～97.50%。
表1 血液透析患者感染的HCV分离株间E2/NS1区核苷酸序列同源性的比较(%)
分离株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1
100.00
2 65.00 100.00
3 83.75 66.25 100.00
4 88.75 63.75 87.50 100.00
5 85.00 62.50 86.25 95.00 100.00
6 86.25 63.75 87.50 92.50 92.50 100.00
7 87.50 63.75 91.25 90.00 90.00 80.00 100.00
8 93.75 65.00 82.50 85.00 86.25 85.00 83.75 100.00
9 60.00 63.75 61.25 57.50 60.00 58.75 61.25 62.50 100.00
10 85.00 62.50 91.25 95.00 95.00 91.25 92.50 85.00 58.75 100.00
11 86.25 63.75 90.00 88.75 91.25 87.50 92.50 86.25 63.75 90.00 100.00
12 92.50 63.75 83.75 88.75 90.00 87.50 88.75 97.50 67.50 87.50 88.75 100.00
13 93.75 63.75 81.25 83.75 85.00 85.00上一页 [1] [2] [3] 下一页
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