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奥替普拉诱发人肺腺癌细胞凋亡的研究 |
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细胞定时用胰酶消化收集，离心涂片，甲醇固定，Giemsa染色观察，0.4%台盼蓝鉴定细胞活性。
3.活细胞视频(video time-lapse monitor)观察：将培养细胞及培养皿置于倒置相差显微镜平台上，平台温度与细胞培养箱相同。记录细胞形态变化72小时，视频观察记录的时间比率为1∶720。
4.流式细胞分析(碘化丙啶染色法)：常规胰酶消化制成单细胞悬液，每毫升2×106个细胞，70%乙醇固定，4℃存放。测样前PBS离心沉淀去除固定液，加200 μl核糖核酸酶A(RNaseA)37℃水浴30分钟，再加800 μl碘化丙啶(PI)染色液混匀(0.5 mg/ml)置4℃避光0.5～1小时。用FACScan流式细胞仪测定。实验重复5次。以Cell FIT软件分析处理数据。
5.DNA凝胶电泳分析：各类培养细胞消化传代，在对数生长期进行药物处理。按常规法提取细胞DNA，置于含EBr的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，细胞出现PCD时呈典型的“梯状”条带。
6.细胞毒理的比色法测定(SRB法)：用96孔板，每孔加0.1 ml DMEM(含细胞5 000/孔)，培养24小时；第2天用不同浓度(50、75、100、125、150、200 μg/ml)的奥替普拉分别处理细胞，每组8孔，再培养24小时，48小时或72小时。然后倒去DMEM，每孔加10%三氯醋酸100 μl，30分钟，清水洗4次，空气干燥，再每孔加入0.4% SRB 100 μl，30分钟，再用1%醋酸轻洗4遍，甩干；最后每孔加入10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)200 μl，静置10秒，用酶联免疫仪检测570 nm吸光度值。重复测5次。
结果
1.形态学观察：细胞经奥替普拉(120 μg/ml)处理72小时，可见胞体固缩，胞膜完整或消失，胞浆嗜碱性，核染色质浓缩或断裂。油镜下见细胞膜起泡(blebbing)，部分细胞有凋亡小体(apoptoic bodies)。
2.SRB法筛选奥替普拉剂量：奥替普拉稀释成50、100、150、200、250 μg/ml，加到96孔板培养的GLC细胞中加奥替普拉后第1～4天，每天取1板用SRB法测定GLC细胞相对存活率，由此作出奥替普拉作用于GLC细胞的剂量/时间-反应曲线(图1)。由图1可见奥替普拉短期和低剂量作用细胞，可刺激CLC生长，提高细胞成活率。在24～28小时之间细胞存活率的变化较平缓。取48小时实验结果，作奥替普拉浓度与细胞相对生存率关系图(图2)。用作图法可求出ID20(20%致死量)对应的浓度为140 μg/ml，ID5对应的浓度为95 μg/ml。从而认定95～140 μg/ml是奥替普拉诱导GLC凋亡的大致范围。
图1 奥替普拉作用于GLC细胞的剂量-时间反应曲线
图2 奥替普拉浓度与GLC细胞相对生存率关系图
3.流式细胞仪分析细胞凋亡：奥替普拉配成90～140 μg/ml的系列浓度，分别作用于GLC细胞，并设对照。用流式细胞仪分析奥替普拉诱导GLC细胞凋亡的百分数(n=5)，对照组为(3.1±0.2)%、90 μg/ml组(3.3±0.3)%、100 μg/ml组(3.4±0.3)%、110 μg/ml组(8.7±1.4)%、120 μg/ml组(18.1±3.7)%、130 μg/ml组(11.9±3.2)%、140 μg/ml组(4.5±0.5)%。在流式细胞拟合图上，发生凋亡时出现亚G1峰，即亚二倍体峰(图3)，对照组无亚G1峰(图4)。
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