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霍乱弧菌O139的培养及其菌毛提取和鉴定 |
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贾文祥 杜艳 尹致英 刘聪 刘莉 张再容 孙大锡
国外研究者对O139的霍乱毒素（CT）基因、毒素共调菌毛（TCP）基因、辅助定居因子（ACF）基因等都做过分析，发现O139型菌株与E1 Tor型O1菌株具高度同源毒力基因，且毒力蛋白表达的调控也相似。但成人O139型菌株感染的高发病率暗示，潜在的抗毒素免疫并不能对O139型霍乱弧菌感染提供保护［1］。此后，研究热点逐渐转至定居小肠的抗原成分上。霍乱弧菌必需粘附于小肠上皮细胞，定居小肠并分泌外毒素，最终导致细胞内液体大量外流。国外学者认为影响霍乱弧菌粘附和定居的因素有很多，包括脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、菌毛、血凝素等，而关于O139型菌株的培养条件、定居因子TCP的高表达及其提取鉴定，国内外人员较少涉及，作者拟就此作一些初探。
一、材料和方法
1.菌株：O139型M045株（国际标准印度株），El Tor型95-026株（小川型）。
2.检测试剂：①TcpA6为人工合成多肽，单克隆抗体为抗TcpA6，由美国田纳西大学Taylor RK教授制备；②羊抗鼠IgG-HRP(标准分子量17 000-94 000)购自华美生物工程公司。
3.培养基：①Luria肉汤（LB），pH值6.7；②AKI培养基［2］，pH值7.0；③定居固子琼脂培养基(CFA)［3］，pH值6.7。
4.培养条件：①AKI培养基，先30℃厌氧培养6～7小时后转有氧环境24～36小时；②CFA培养基，30℃有氧培养36～48小时。
5.TCP菌毛提取方法：①见文献［2］，将收集的菌体悬浮于10 mmol/L（PBS+EDTA）中，洗涤后经过4.5号针2～3次；加乙醇胺多次搅拌、反复离心，上清经透析、浓缩即得。②见文献［3］，用PBS集菌，56℃水浴振荡后离心，上清过膜、透析、硫酸铵沉淀即得。
6.电子显微镜技术：用接种环挑取平板上少许菌落，玻片上稀释，将蘸有菌稀释液的铜网经1%磷钨酸负染，滤纸吸去多余液体，电镜观察。
7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：参照Laemmli［4］方法，滤膜水平电泳槽，10%凝胶，电压60 V，时间5～6小时。
8.斑点酶免疫反应（dot blot immunoassay）：包被液稀释的待测抗原（O139型M045株和El Tor型95-026株的TCP）各2 μl，点样于包被液浸泡过的硝酸纤维膜上；自然干燥后用含1%小牛血清的PBS封闭，再加1% McAb室温过夜，PBS-Tween洗膜，加羊抗鼠IgG-HRP作用，底物液显色，TE缓冲液终止反应［5］。
二、结果
1.霍乱弧菌O139型M045株和El Tor型95-026株在AKI、CFA培养基30℃均生长良好。研究发现固体培养基比液体培养基、静止培养比振荡培养更有利于菌毛生长。
2.菌毛提取量：AKI培养基中相同条件下，800 ml M045株抽提的粗提菌毛量约为391 mg；800 ml 95-026株抽提的菌毛量约为3 528 mg。两者约相差9倍，El Tor型明显高于O139型。
3.电镜照片显示：AKI培养基中易于见到束状毒素共调菌毛，而CFA培养基中则多见菌体周围遍布的短、粗、杂草状菌毛。El Tor型菌株易见到鞭毛，O139型菌株则未见到。
4.SDS-PAGE电泳结果：M045株和95-026株提取纯化的菌毛都存在分子量为20 500条带。
5.DBI结果：M045株和95-026株分别在硝酸纤维膜上出现明显的斑点，可知M045株和95-026株的TcpA存在同源性。
三、讨论
霍乱弧菌之所以难成有效的菌苗，除了霍乱弧菌的有效保护性抗原成分不清楚之外，还与其抗原漂移和足够有效抗原剂量以及免疫效果、维持时间长短等有关。霍乱弧菌所产生的TCP是诱导霍乱免疫的重要成分之一，许多研究者对TCP的纯化方法、生物学特性、致病机理、免疫原性以及用于霍乱菌苗等方面做了研究。关于TCP，Taylor 和Miller［6］最早报道，指出TCP在乳鼠霍乱模型中为重要的定居因子，随后在人类得到证实［7］。1989年Sharma等［8］报道TCP中分子量为20 500的蛋白质是构成菌毛的主要亚单位，由它所诱导产生的抗体能阻断细菌对肠上皮的粘附，防止感染并有效保护乳鼠对霍乱弧菌的攻击。El Tor型和O139型菌株的有效定居小肠，依赖于T[1] [2] 下一页
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