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中间偃麦草单条染色体分离及体外扩增 |
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方法
1.2.1 染色体标本的制作
取供试材料于减数分裂中期Ⅰ或后期Ⅰ的小穗，用新配制的卡诺固定液(95％酒精∶冰醋酸=3∶1)固定15 min后,70％酒精4 ℃保存。剥离出花药放入酶解液中（2.0％纤维素酶和2.5％果胶酶)37℃酶解0.5～1 h，在蒸馏水中低渗10～30 min，置于载片上直接压片，在相差显微镜(Olympus BH)下镜检，取合适分裂相的染色体标本用液氮迅速冷冻揭片，立即用于染色体分离或置于－20℃冰箱内短期保存。
1.2.2 微细玻璃针的制作
医用采耳血的毛细玻璃管在竖式拉针仪(NARISHIGE MODEL PB－7)上，拉成1μm左右的微细玻璃针，在微弱的酒精灯上将针尖端部分弯成约120度角；或用手工拉制玻璃针，在微弱的酒精灯上将毛细玻璃管加热迅速拉成微细玻璃针。
1.2.3 染色体显微分离
将显微操作系统(NARISHIGH MO202)安装在倒置显微镜(Olympus IMT2)上，微细玻璃针固定于显微操作臂上。取已制好的染色体标本在20倍物镜、20倍目镜下选取所需分裂相。找到目标染色体，用自制的微细玻璃针挑取目标染色体，将粘在微细玻璃针上的染色体连同针尖一同折断于装有蛋白酶K的小离心管中，放入4℃冰箱备用。
1.2.4 染色体DNA消化
向内含单条染色体的0.5ml离心管内加入10μl蛋白酶K反应液，蛋白酶K反应液包括下列成分：
1% detergent(10μ1 Tween20+990μ1H2O 4.5μ1
MgCl2(2.5mmol/L) 1μ1
10×Buffer(100mmol/L Tria-HCl pH=8.3,50mmol/L KCl) 1μ1
蛋白酶K(10mg/L) 1μ1
灭菌超纯水 2.5μ1
55℃保温3h，95℃10min蛋白酶K灭活。
1.2.5 分离的染色体DNA酶切
向上述DNA混合液中加入2～4U的Sau3AI，
DNA混合液 10μ1
10×Buffer 1μ1
Sau3AI(4U/μ1) 1μ1
合计 12μ1
37℃保温6小时左右，70℃30分钟Sau3AI酶灭活。
1.2.6 连接接头
引物设计: 染色体DNA经Sau3AI酶切后，每个DNA片段都带有GATC末端。为了从切割的染色体中较为全面的扩增出DNA片段，设计的两个引物配对后形成的末端必须能与染色体DNA的末端配对，我们根据引物合成的原则，合成了两个引物
引物I：5＇CGG GAA TTC TGG CTC TGC GACATG 3＇引物II：3＇CTGTACCTAG 5＇
制备接头:将引物I，引物II等浓度（约30pmol/μl）等体积混合，58℃保温3小时，形成接头。
连接接头:在上述酶切的染色体DNA混合液中，加入接头和 T4 DNA连接酶，15℃下连接2 h。
酶切后的DNA混合液 12μ1
引物I(29.5pmol/μ1) 8μ1
接头(29.5pmol/μ1) 4μ1
10×Buffer 3μ1
T4DNA连接酶(2U/μ1) 3μ1
合计 30μ1
1.2.7 PCR扩增
（1)第一轮PCR扩增
在上述连接好的染色体DNA混合液中，加入下列成分
DNA混合液 30μ1
dNTP(2.5pmol/μ1) 8μ1
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