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利用RAPD标记构建美洲黑杨 欧美分子标记连锁图谱 |
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(2C=1.2pg[5，6])，染色体数目一致(2n=38)，易于进行遗传研究；杨树是严格异交树种，使位点组成高度杂合，有利于遗传图谱的构建。
鉴于杨树在林木研究和生产中占有重要地位，开展杨树遗传图谱构建研究不仅对于深入开展我国杨树遗传育种研究有重要意义，而且也将促进整个林木遗传研究的发展。本研究以美洲黑杨×欧美杨的F1为材料，利用RAPD分子标记构建了遗传连锁图谱。
1 材 料 与 方 法
1.1 试验材料
作图群体为“三交”群体，以美洲黑杨(P.deltoides)为母本，欧美杨(P.euramericana)为父本，其F1代均栽植于南京林业大学杨树育种圃内。从400个F1无性系中随机抽取90个无性系，包括亲本共92个无性系作为作图群体。
1.2 DNA提取
取新鲜叶片0.1g于液氮中迅速研磨成粉末，转入预热的600μlCTAB提取液(10mmol/L TrisHcl,pH8.0，20mmol/L EDTA,pH8.0，1.4mol/L NaCl,1％CTAB,5％PVP,350mmol/L βmercaptoethanol)中，于65℃下水浴30min，并不时摇匀振荡；取出样品冰浴至室温加入氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分振荡离心10分钟(10 000r/min)，取上清加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，－20℃冰冻2h；离心弃水相留沉淀使其自然风干；加500μl TE溶解沉淀，用等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次和氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次后，加入1／10体积的3mol/L NaAc pH5.2和2倍体积的无水乙醇；置20℃冰冻2h，离心后将沉淀用70％乙醇洗2次，风干后溶于适量TE中保存。
1.3 RAPD扩增
RAPD扩增在PerkinElmer9600扩增仪上进行。反应总体积为20μl：20ng左右模板DNA；引物0.5μmol/L；Taq酶1.0U(中国农大生物技术实验室产品)；dNTP各200μmol/L；2.0μl10倍反应溶液(100μmol/L TrisCl,pH8.3，500mmol/L KCl,22.5mmol/L MgCl2，0.01％明胶，5.0g/L BSA)[3]。扩增程序为：94℃预变性2min，然后进入循环，94℃变性30s，40℃复性30s，72℃延伸2min，共38个循环，最后在72℃延伸7min，结束后保存在4℃条件下。扩增产物经1.2％的琼脂糖凝胶检测分析。
实验所用的RAPD扩增引物购自美国Operon公司。
1.4 引物筛选
用1个DNA样品对1040个寡核苷酸随机引物进行初筛，筛选出有扩增产物的引物；然后用8个DNA样品(双亲及6个子代)对有产物的引物进行复筛，即筛选在双亲及F1中存在多态性的引物，利用筛选出的具有稳定多态的引物对92个DNA样品进行PCR反应，获得RAPD标记。
1.5 连锁分析与图谱构建
RAPD扩增产物经电泳检测后，进行数据收集，根据带的有无分别赋值为“1”和“0”，模糊不清或数据缺失者赋值为“—”。利用χ2检验，符合1∶1分离的RAPD标记用于图谱构建，对所得数据均进行互补复制，采用MAPMAKER/EXP1.1软件[7]，在苹果机上对该作图群体进行图谱构建。先利用两点分析，计算所有成对座位的最大重组率和最小LOD值，推测可能的连锁群，要求最小LOD4.0，最大重组率0.25。然后对每个连锁群中的标记进行多点分析，确定最大的似然图谱，并根据Kosambi函数[8]，将重组率转换成图距单位(centimorgan,cM)。
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