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猪雌激素受体基因 ESR 点突变的PCR SSCP检测 |
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易混淆，致使AB型与AA型不易区分。DNA的碱基置换突变（点突变）会造成单链的分化折叠，使单链泳动的速度不同，造成了DNA的单链构象多态（singlestranded conformation polymorphism,SSCP）［9］。因此，将PCR产物进行SSCP分析是检测点突变常用的方法之一［10］。与PCR－RFLP相比，PCR－SSCP的方法检测的突变位点的种类和数量更丰富,检测的灵敏度较高;而且所需要的设备较为简单,一般的分子生物学或生化实验室都可以进行。鉴于此，我们建立了一种PCR－SSCP的方法对猪ESR的点突变进行检测。
1 材 料 与 方 法
1.1 实验材料
猪的耳组织样分别取自江西省种猪场和北京昌平实验站，放入70％乙醇中，带回实验室于－20℃冰箱中保存。各种限制酶购自华美生物工程公司，Taq DNA聚合酶购自Gibco BRL公司，dNTP购自PE公司,丙烯酰胺、N,N －亚甲双丙烯酰胺以及甘油等均购自北京化学试剂公司。
1.2 猪耳组织基因组DNA的提取
取一块耳组织（约10mg）置入1.5ml离心管内，用小剪刀将其剪碎。加入0.4ml组织DNA提取液［50mmol/L Tris－Cl(pH8.0),100mmol/L EDTA(pH8.0),100mmol/L NaCl,1％SDS］,再加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml,55℃水浴消化过夜。加入RNase至终浓度20ng/ml,37℃温育1h。苯酚，苯酚：氯仿（1：1）和氯仿各抽提一次，每次12，000r/min,10min，将上清移到另一个离心管中。加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2),混匀后加入2×体积的无水乙醇沉淀DNA;将DNA絮状沉淀挑入新离心管中并用70％乙醇洗一次，真空抽干乙醇。以适量TE或灭菌双蒸水溶解DNA。
1.3 PCR反应程序及PCR产物检测
按照Short等（1997）的方法设计PCR引物,P1:5 －CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG－3 ;P2:5 －CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG－3 ,反应程序参照Short等（1997）并稍做修改:在25μl反应体系中混合2.5μl 10×buffer［500mmol/L KCl,100mmol/L Tris.Cl(pH8.3),15mmol/L MgCl2,0.1％明胶］,2μl 2.5mmol/L dNTPs,上游引物P1和下游引物P2（均为25μmol/L）各1μl,Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.25μl,基因组DNA(100ng/μl)1μl,加ddH2O至25μl.按95℃ 7min，然后95℃ 1min，57℃ 35秒，72℃ 45秒循环30次，72℃ 7min延伸进行PCR反应。PCR产物在3％的琼脂糖凝胶中检测。
1.4 SSCP分析
1.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取1μl PCR产物加入5μl上样缓冲液［98％甲酰胺，10mmol/L EDTA(pH 8.0),0.025％二甲苯青F F,0.025％溴酚蓝，10％甘油］，98℃变性5min后迅速插入冰中至少5min，然后上样于15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：N,N －亚甲双丙烯酰胺=29：1，5％甘油）中，4℃ 5W电泳10～14h。
1.4.2 银染：电泳结束以后首先在70％乙醇中固定10～15min，用去离子水洗2次，每次2～3min；银染30min（100ml染色液中含NH3.H2O 1ml,0.36％ NaOH 21ml,20％ AgNO3 1.8ml）后用去离子水洗3～4次，每次2～3min；加入显色液（200ml显色液中含1％柠檬酸钠1ml,甲醛100μl），待电泳条带清晰后换上去离子水停显。
1.4.3 带型分析：由点突变造成的3种基因型在非变性聚丙烯酰胺凝胶上表现为3种构象:AA,BB均为2条带,但位置有明显区别,AB则包含以上4条带;另外,异源双链体也有助于判别基因型。
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