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脂质刺激的Kupffer细胞对肝星状细胞增殖的影响 |
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肝细胞在脂质代谢和转运中的作用已有较多的阐述，而对肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)、Kupffer细胞、窦内皮细胞等在脂质中不断增多的研究显示，HSC、Kupffer细胞等均参与脂质的代谢和转运，其异常与脂肪肝、肝纤维化的发生有关［1，2］。我们观察了脂质［甘油三酯和极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)］刺激的Kupffer细胞培养的上清液(Kupffer cell-conditioned medium，KCCM)对HSC增殖的影响，以探讨脂质在HSC激活中的作用及其机制，为脂肪肝、肝纤维化的防治提供理论依据。
材料与方法
一、实验动物
Wistar雄性大鼠，体重400～450 g，购自中国科学院上海实验动物中心。普通饲料喂养，自由进食。
二、HSC和Kupffer细胞的分离、培养和鉴定
按Baroni等［3］的方法并加以改进［4］。用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流，Nycodenz(Sigma)密度梯度离心分离大鼠HSC和Kupffer细胞，锥虫蓝染色判断存活率并计算产率。用兔抗人Desmin、Lysozyme、Factor-Ⅷ相关抗原对HSC、Kupffer细胞作SP免疫组化染色(福州迈新公司产品)。Kupffer细胞培养于6孔培养皿内，分别加入20 μl India ink(以1%明胶稀释20倍)和40 μl Latex beads(颗粒直径0.885 μm，Sigma)，倒置显微镜观察Kupffer细胞吞噬功能［4］。同时将Kupffer细胞用2%戊二醛固定24小时后，按常规方法进行透射电镜观察。
三、KCCM制备
Kupffer细胞生长接近80%融合时在培养基中分别加入VLDL(25 mg/L)和甘油三酯(25 mg/L)培养48小时，收集培养液，用透析袋(分子截止值为8 000～10 000，Spectrum Medical Industries Inc.,USA)透析［5，6］，透析液用孔径0.45 μm滤过器过滤，制得KCCM。
四、MTT比色法
原代培养的HSC长满单层后用胰酶消化后，调整细胞数为1×105个/ml，以每孔100 μl加入96孔培养板内。置培养箱内预培养72小时后，分组并加入不同浓度的VLDL、甘油三酯和KCCM，每组设5个复孔。用酶标仪(E-Liza Mat-3000)双波长测定其吸光度(A)［2］。测定波长为570 nm，参考波长为630 nm。
五、统计学处理
采用卡方检验。
结果
一、HSC和Kupffer细胞的得率、纯度和鉴定
用本法分离的HSC和Kupffer细胞，其得率分别为5×106～1×107及(3～5)×106/肝，以0.4%锥虫蓝染色，细胞存活率在95%以上，免疫组化原代HSC Desmin阳性在90%以上，传代培养在98%以上。Kupffer细胞兔抗人Lysozyme染色第1天阳性细胞数在80%以上，第7天阳性细胞数达95%。在328 nm波长紫外光照射下，HSC呈现蓝绿色自发荧光，而Kupffer细胞无此现象。SP免疫组化HSC示Desmin(+)，Lysozyme(-)，Factor-Ⅷ(-)。Kupffer细胞示Desmin(-)，Lysozyme(+)，Factor-Ⅷ(-)。光镜下见Kupffer细胞胞浆内吞噬的India ink及Latex beads颗粒。透射电镜观察可见Kupffer细胞胞浆内含大量溶酶体及吞噬的Latex beads颗粒［4］。
二、甘油三酯和VLDL对大鼠HSC增殖的影响
甘油三酯浓度为12.5 mg/L对HSC有增殖作用(P<0.05)，而25、50、100、200 mg/L对HSC无影响(P>0.05)，但400 mg/L对HSC增殖有抑制作用(P<0.01)。VLDL 6.25、12.5 mg/L对HSC增殖无明显影响(P>0.05)，但随着浓度增大，25、50、100 mg/L的VLDL则促进HSC增殖(P<0.05或P<0.01)(见表1)。
表1 甘油三酯和VLDL对HSC增殖的影响
组别 浓度
(mg/L) A值 组别 浓度
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