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流式细胞术检测反义核酸对HLA |
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冯志华 周永兴 姚志强 张盈华 陈从新 张文彬
* 互补基因位点对应于Ono等发表的adr亚型HBV全基因序列 人类白细胞抗原中Ⅰ类抗原(HLA-Ⅰ)很少或不表达于正常肝细胞膜［1］。乙型肝炎病毒(HBV)感染可诱导HLA-Ⅰ在肝细胞膜上的表达，进一步的研究表明，HLA-Ⅰ的表达与HBV X基因产物反式激活作用有关［2］，而前者的表达又可促进细胞毒T细胞(CTL)对感染肝细胞的双重识别和杀伤，造成肝细胞的破坏。本研究人工合成了互补于HBV X基因关键区的反义核酸(antisense oligodeoxy-
nucleotides, ASODN)，采用流式细胞术，观察了ASODN对2，2，15细胞膜HLA-Ⅰ表达的影响，为寻找防治慢性与重型乙型肝炎的药剂提供理论和实验依据。
材料和方法
一、材料
HBV基因转染的HepG2细胞(即2，2，15细胞)——中国医学科学院药物技术研究所；HLA-Ⅰ重链多肽区McAb——武汉生物制品研究所；FITC标记的羊抗鼠IgG——美国Sigma公司；EPICS profile Ⅱ型流式细胞仪——美国Coulter公司。
二、方法
(一)硫代磷酸ASODN的合成
DNA合成仪上分别合成互补于HBV X基因序列1510～1530、1555～1581、1768～1791区的ASODN，同时合成与1510～1530区相同的正义序列(SODN)作为对照。各段寡聚物互补基因位点及其碱基序列见附表。
(二) 细胞表面HLA-Ⅰ的检测 2，2，15细胞以2×105接种于Nunclon 24孔培养板，待细胞长成单层，换液并同时分别加入ASODN序列Ⅰ～Ⅲ，并设SODN(序列Ⅳ)及空白对照组。ASODN和SODN浓度均为20μmol/L，每组设3个复孔，作用72小时后分别收集细胞→与工作浓度HLA-ⅠMcAb于4°C混合30分钟→洗涤2次→与FITC标记羊抗鼠IgG于4°C混合30分钟→洗涤后加固定液→流式细胞仪(FCM)检测。
附表 ASODN互补基因位点及碱基序列
序列编号 基因位点 碱基序列*
Ⅰ 1510-1530(21聚) GGTGCGCCCCGTGGTCGGCCG
Ⅱ 1555-1581(27聚) CACACGGTCCGGCAGATGAGAAGGCAC
Ⅲ 1768-1791(24聚) TATGCCTACAGCCTCCCAGTACAA
Ⅳ 1510-1530的正义序列 CGGCCGACCACGGGGCGCACC
结果和讨论
我们设计的针对HBV X基因的ASODN Ⅰ～Ⅲ序列，作用于2，2，15细胞72小时，均可抑制细胞膜表面HLA-Ⅰ表达，而SODN这种抑制作用不明显，表达率分别为序列Ⅰ：5.7%，序列Ⅱ：10.8%，序列Ⅲ：2.3%，序列Ⅳ：81.4%，空白对照组：93.2%。
HLA抗原不仅是移植抗原，而且在免疫细胞间勾通信息、双重识别与调控中发挥着重要作用。已证明，HLA参与抗原的呈递，介导T细胞激活；随着肝内炎症活动的加剧，肝细胞HLA-Ⅰ表达增强，CTL反应增强［3］。可见，降低HLA-Ⅰ在肝细胞的过度表达，同时配伍高效抗病毒制剂，可防治肝细胞的大片坏死，阻止慢性及重型肝炎的发生。
Zhou等［2］研究表明，HBV DNA转染细胞后，HLA-Ⅰ表达率比未经转染的细胞要高3～4倍，而且这种增高是通过HBxAg对HLA-Ⅰ基因启动子的反式激活造成的。本实验设计的针对X基因高度保守关键区ASODN，不仅可以抑制HBxAg表达［4］，FCM结果表明还可抑制HLA-Ⅰ在肝细胞膜表面的表达。从而推测，HLA-Ⅰ表达的抑制作用可能是通过HBxAg序列特异性抑制HBxAg表达，使后者对HLA-Ⅰ启动子的激活降低而实现的。
作者单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院
参考文献
1 Natali PG, Bigotti A, Nicotra MR, et al. Distribution of human class I (HLA-A,B,C) histocompatibilit[1] [2] 下一页
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