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间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用 |
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腹腔后主要由腹腔中的巨噬细胞将其吞噬、杀灭，净化腹腔，从而维持腹膜的正常结构和功能。但近年研究报道，接受腹膜透析的患者腹腔巨噬细胞吞噬功能明显降低［1］，而腹膜间皮细胞却显示出某些潜在的功能，如通过分泌白细胞介素-1(IL-1)和前列腺素等促炎症介质［2，3］，参与腹膜抗感染过程。目前，对间皮细胞在腹膜炎症中 的抗菌防御作用仍知之甚少，特别是腹膜炎初发期，当循环中的调理素尚未到达腹腔，而细菌却大量繁殖，间皮细胞作为首先与细菌接触的表面，是被动受害还是主动参与腹膜抗感染过程，目前尚未见报道。为此，本实验模拟腹腔细菌感染内环境，研究细菌毒素和IL-1诱导体外培养的腹膜间皮细胞粘附分子的表达，及其对细菌粘附和腹腔吞噬细胞表面吞噬作用的影响，以探讨间皮细胞在腹膜抗菌防御中的作用。
材料和方法
1.大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养和鉴定：按照本室先前建立的人腹膜间皮细胞分离、培养方法［2］，稍加改良。即：无菌取5只SD大鼠小网膜和肠系膜，分别用Hank液洗数次，剪碎，用胰蛋白酶/EDTA消化15分钟，37℃不断震摇，终止消化后1 000 r/min，离心10分钟，弃上清，用含5 mg/L转铁蛋白、1 mg/L氢化可的松、2 mmol/L的L-谷胺酰氨和10% FCS的完全RPMI-1640培养液重悬细胞，调整细胞数为1×105/ml浓度，接种在包被明胶的培养瓶中，37℃、5% CO2培养箱中培养。传代细胞经形态学和超微结构鉴定具有间皮细胞特征。免疫组化示抗细胞角蛋白、抗波形蛋白(vimentin)抗体(购自DAKO公司)染色阳性，抗第Ⅷ因子相关抗原(购自DAKO公司)和抗白细胞CD45抗原的抗体(购自军事医学科学院)染色阴性。
2.间皮细胞表面粘附分子的诱生及检测：取第三代间皮细胞以1×106/ml浓度接种于改良的Petri培养皿中，置37℃、5% CO2培养箱中过夜。设四个组，两个皿为一组，次日于每组培养上清中加入LPS(Sigma产品)、金葡菌肠毒素(本校微生物教研室惠赠)或IL-1(购自军事医学科学院)刺激培养，第四组是对照组，为10% FCS的RPMI-1640培养(不加任何刺激因素)；另设一个阴性参照皿(用IL-1刺激，但不染“一抗”)。刺激剂量LPS和金葡菌肠毒素组终浓度均为5 mg/L、IL-1组为5 U/ml，刺激培养时间为6小时。培养结束后，用PBS洗培养皿3次，弃净液体后加1%多聚甲醛固定细胞5分钟，再用PBS洗3次，吸干皿孔内液体，于每组的第一个Petri培养皿内加入100 μl抗ICAM-1抗体(CD54单克隆抗体，美国NeoMarkers公司产品)，第二个Petri培养皿内加入100 μl抗血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)抗体(CD106单克隆抗体，法国Immunotech公司产品)，阴性参照皿加含1% BSA的PBS，室温放置45分钟，然后用PBS洗掉未结合的“一抗”，同法于每皿孔内加入100 μl适当稀释的羊抗鼠荧光抗体(法国Immunotech公司产品)，室温避光放置30分钟，用PBS洗净未结合的“二抗”。样本经上述步骤标记好后，在粘附式细胞仪(ACAS 570型，美国)进行荧光强度测定。选择紫外波长为488 nm，每例样本测定100个以上细胞，以平均荧光值(AV)为定量参数。
3.细菌及其调理过程：取金黄色葡萄球菌(本校微生物教研室提供)接种在不含抗菌素和含5%混合人血清的RPMI-1640培养液中，37℃水浴摇床，150 r/min，60分钟，然后4℃、1 000 r/min，离心30分钟，被调理的细菌重悬在RPMI-1640培养液中，配成1×108/ml浓度菌液，4℃保存备用。未被调理的细菌以同样方式在无血清液体中进行。
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