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聚合酶链反应快速检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究 |
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自1961年发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以来，特别是80年代后，MRSA感染率不断上升，由于其具有多重耐药性，给临床治疗带来困难［1］。MRSA菌株的检出率在常规培养条件及药敏试验中受到培养基成分，特别是pH、NaCl含量、细菌接种量、孵育时间及孵育温度以及培养基中是否加诱导剂等多种因素的影响［2］，从表型上进行诊断，结果有时不够准确。聚合酶链反应(PCR)检出耐甲氧西林葡萄球菌，主要通过该法扩增编码耐药菌特异的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的mecA基因来鉴定该菌是否为耐药菌，从基因序列上进行诊断，为临床快速准确诊断MRSA感染，选择合理的治疗方案提供了极大便利。本研究利用PCR技术对临床分离的184株金黄色葡萄球菌(金葡菌)进行检测，并与药敏检测方法进行比较，结果报道如下。
材料与方法
一、菌株
184株金葡菌为我院1994年1月至1996年1月临床各科分离，并为本实验室所保存的菌种，用常规方法及生化试验重新鉴定。
二、主要试剂及仪器
Taq DNA多聚酶5 U/μl，PE，美国产品；PCR标记物购自华美生物工程公司，片段大小为1543 bp、994 bp、695 bp、377 bp、237 bp；苯唑西林为卫生部国家医药管理局暂行标准品，1 mg相当于910 U；超速低温离心机MR18.22型，法国Jouan公司产品；PCR仪为DNA热循环仪480型(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT，USA)。
三、寡核苷酸引物及探针
寡核苷酸委托中国科学院微生物研究所在OLIGD 1000 DNA合成仪上合成，参照Murakami等［3］报道的寡核苷酸序列：
primer 1：5′1282 AAAATCGATGGTAAA-GGTTGGC1303 3′
primer 2：5′1793 AGTTCTGCAGTACCG-GATTTGC1814 3′
probe：5′1581 ATCTGTACTGGGTTAATC1598 3′
四、模板DNA的制备
采用粗提DNA为模板，利用碱煮沸法，将平板上的单个菌落用1 ml TNE(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA)洗涤，15 000 g离心5分钟，沉淀悬于50 μl 0.5 mol/L KOH中，100℃煮沸5分钟，然后加入1 mol/L Tris-HCl(pH 6.76)50 μl，混匀，15 000 g离心5分钟，吸10 μl上清液作为PCR扩增模板。PCR敏感性测定时将增菌液作10倍递减稀释后按上述方法抽提DNA。
五、PCR扩增
扩增反应总体积为50 μl，其中灭菌重蒸水23 μl、10×PCR反应缓冲液5 μl、15 mmol/L MgCl2 5 μl、2.0 mmol/L dNTP 5 μl、25 pmol/L引物各1 μl、模板DNA 10 μl、1.5 U Taq DNA多聚酶。置DNA扩增仪上进行自动化扩增反应，循环参数为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 100秒，共30个循环，最后一个循环于72℃，延伸时间延长至5分钟。
六、扩增产物分析
采用琼脂糖凝胶电泳法，以PCR标记物分子量标准，在含0.5 μg/ml溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶中电泳30分钟，在紫外灯下观察结果并照相。
七、Southern blot分析
参照文献［4］，利用末端转移酶对寡核苷酸3′末端进行酶促生物素(Bio-11-dUTP)标记，用Sephadex G-50柱分离纯化标记的探针。采用毛细管转移法将DNA从琼脂糖凝胶中转移至硝酸纤维滤膜上。标记的探针然后与固定于滤膜上的DNA进行杂交，杂交液中含5×Denhardt试剂，50%甲酰胺，杂交温度42℃，杂交过夜，然后进行洗膜。探针标记物采用生物素-链抗生素蛋白-碱性磷酸酶显色体系进行检测。
八、苯唑西林对葡萄球菌体外敏感试验
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