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中国人群2型糖尿病患者付氧酶基因多态性与冠心病关系的研究 |
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础与并发CAD有关。近来研究血清中存在一种被称作付氧酶(paraoxonase, PON)的糖蛋白，它与较大的高密度脂蛋白(HDL)颗粒(即含apoA-I和apoJ的HDL)紧密结合。众多证据表明PON在体外能水解脂质过氧化物，减少LDL的氧化，对CAD发病有预防作用。本研究应用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术筛查PON基因全部外显子，以探讨我国2型糖尿病患者PON基因与并发CAD的关系。
对象和方法
一、对象
CAD合并2型糖尿病组49例，男28，女21，年龄(65.7±7.5)岁，除临床诊断陈旧性心肌梗死6例和急性心肌梗死1例外，其余均有冠状动脉造影依据；单纯糖尿病对照组49例，男27，女22，年龄(54.1±11.5)岁，临床上经询问病史、体检、实验室和心电图检查排除CAD；正常对照组101名，男59，女42，年龄(49.8±9.3)岁，为常规体检者，无CAD病史、体征、实验室检查及心电图依据。
二、实验方法
1.基因组DNA制备：采外周血5ml，溶解红细胞后，用蛋白酶K消化法和酚/氯仿抽提白细胞中基因组DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)引物及条件：应用Bio-Rad公司MacMelt软件设计9对引物(表1)，扩增所有外显子及其两翼部分内含子序列，根据PCR扩增片段的模拟电泳解离行为，在一侧引物的5’端加由40G/C碱基组成的“GC-夹”，使PCR产物一端形成熔点(Tm)较高不易解链的“夹子”。在50μl PCR扩增体系中，基因组DNA 200～500ng，dNTP 0.2 mmol/L，引物0.15～0.45μmol/L，MgCl2 1.5～2.0 mmol/L，1×缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L pH 8.3，KCl 50mmol/L，0.01%明胶)，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1U。经94℃变性5分钟，再经94℃(变性)，45秒；51℃～62℃(退火)，1分钟；72℃(延伸)，1分钟，循环扩增35个周期，72℃继续延伸10分钟。
表1 PCR引物序列
Tab 1 Primer sequences of PCR
外显子
Exon 名称
Name 引物序列
Primer sequence
(5'→3') 扩增片段
Amplification
fragment
(bp)
1 1F GC-CCTAGCCCGTCGGTGTCTG 209
1R AGTGAGGAGGACGAAGGCTG
2 2F GC-CTGAATAGTTTTGTGTGTGTT 184
2R AATGAGACCCTTCTTCCTC
3 3F GC-AATAATATGAAACAACCTGTACTT 186
3R CCTAGAAAACGTTCTAGAACAC
4 4F GC-ATTGTGCTTGATTTTTCTCCTC 284
4R TAAGTTTGGTTTTGGTTTTAATAA
5 5F GC-CAGTGAGAGCTTAGTTAATGTT 248
5R TAAAGGAAAATAGAAATGTGATAT
6 6F GC-CTTATATATTATGTGTGTATGTTT 302
6R TCCACTACATTTCAGAGAGTT
7 7F GC-AGTACTTGATGTAGCTCTTTC 194
7R TAATTATCACTCTGCAGACTT
8 8F GC-GTGTTTTACTTTATGTCTTGTT 249
8R AAGTCACTTATCTGGTTCATT
9 9F GC-GCATAAGGTTGTTTTAAGTGAC 295
9R GCCTCAGTTTCTATGGCATG
注：“GC-”=5' CGCCC GCCGC GCCCC GCGCC CGTCC CGCCG CCCCC GCCGC 3'
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