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一氧化氮在实验性骨关节炎软骨细胞凋亡中的作用 |
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料与方法
1.1 分组及模型制作：新西兰健康白兔28只，雌雄不限，平均体重2.5 kg，右后下肢膝关节伸直位石膏管型固定。实验动物分两组：Ⅰ石膏固定组；Ⅱ L-NAME＋石膏固定组。石膏固定后，由兔耳缘静脉中注射L-NAME 15 mg/kg(溶于1 ml生理盐水)，每周注射2次。按观察时间分为2、4、6周三个时期，并分别按期进行观察，每期4只。4只用于正常对照组。
1.2 膝关节滑液的抽取：施行膝关节穿刺证实刺入关节腔后，注入0.9%生理盐水1 ml，反复回抽并注入3次后，再尽量将液体抽出并注入试管内，封存于－70 ℃低温环境内备测。
1.3 NO－2测定：鉴于NO的性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定标本中的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度可作为衡量NO合成的指标。本实验对亚硝酸盐的测定参照文献［6］报告，采用镀铜镉还原法，抽取标本0.3 ml，加重蒸水0.6 ml，5%硫酸锌0.3 ml，0.3 mol NaOH 0.3 ml，混匀置4 ℃冰箱内20 min，10 000 r/min，离心5 min，取上清液1 ml加入镀铜镉反应80 min，收集上液1 ml与不同亚硝酸钠标准品分别加1%磺胺(5%磷酸配制)，0.1% N-1萘乙二胺盐酸盐水溶液各0.5 ml混合，置室温10 min，用分光光度计测A546值。根据不同浓度标准品A值绘制标准曲线。按照样品A值在标准曲线上查出样品含量。
1.4 TUNEL末端荧光标记法：以Boehringer Mann公司细胞凋亡检测试剂盒，对软骨细胞DNA断端进行标记。按说明进行操作：软骨组织行冰冻切片后，用4%多聚甲醛溶液在室温下固定20 min，然后加入细胞通透液(0.1% TritonX-100＋0.1%枸橼酸钠)，0.01 mol/L PBS洗2次，擦片后加入50 μl TUNEL反应混合液，在37 ℃温箱内加盖孵育60 min，PBS洗3次后，置于荧光显微镜下观察，对有荧光显色者可确认为具有细胞凋亡特征。
2 结 果
2.1 实验性OA中膝关节滑液亚硝酸盐的动态变化：实验组中亚硝酸盐水平(±s)在2、4、6周时分别为(20.3±2.6)、(41.4±1.9)、(86.6±4.6) μmol/L，各试验组中NO水平明显高于正常对照组(6.7±1.7) μmol/L(P＜0.01)，制动后2周开始明显升高，6周达高峰。
2.2 L-NAME对膝关节滑液中亚硝酸盐水平的影响：实验动物耳缘静脉注射L-NAME后，可降低其关节液中亚硝酸盐的水平，在2～6周时，分别为(11.5±1.8)、(27.3±4.1)、(60.3±3.7) μmol/L，与单纯固定组比较差异有显著性(P＜0.01)，但仍高于正常对照组。
2.3 TUNEL荧光末端标记：显微荧光镜下观察制动6周后的全层软骨细胞核时，可见有荧光标记的凋亡细胞(图1)；而用L-NAME制动6周时，发现有荧光标记的凋亡细胞较单纯制动6周时明显减少，而且主要分布于表中层，并呈散在性分布(图2)。在正常对照组中则未见荧光标记的软骨细胞(图3)。
3 讨 论
目前对于细胞凋亡发生的机制尚不清楚。近期的研究结果表明，自由基不仅存在于细胞凋亡早期，而且由其造成的损害也可出现于生命后期的退行性疾病中。细胞凋亡细胞中的反应性氧属(ROS)增加，同时其清除反应性氧属的能力相应地下降。大多数细胞凋亡障碍的细胞表现为反应性氧属分子大量减少。若调节细胞内ROS的含量改变，则其死亡率亦随之改变。此种变化提示ROS参与并可调节细胞凋亡的形成过程［7］。NOS作为内源性ROS产生系统之一，在软骨细胞损害的过程中有高表达，且可产生高含量活性很强的自由基NO［3］。有人发现NO释放复合物作为一个NO的供体可以通过一定时间和浓度依赖的方式诱导软骨细胞发生凋亡。在Francisco等的体外试验中发现NO在软骨细胞凋亡中起重要作用，其他一系列细胞调控因子如IL-1、TNF、LPS、氧自由基等均不能诱导软骨细胞发生凋亡现象。由此可以推论NO是引起软骨细胞凋亡的主要介质。NO可能通过以下四个方面的机制使细胞发生凋亡：①抑制三羧酸循环中乌头酸酶的活性，使细胞氧化代谢和呼吸受到干扰，糖原分解，导致糖原衰竭；②直接与某些含亚铁原卟啉的铁离子结合，形成亚硝酰络合物，造成线粒体损害；③引起核酸亚硝酰化，破坏DNA双螺旋结构；④影响细胞内的其他靶分子，调节第二信使，诱导非依赖于基因组DNA损伤的细胞凋亡。业已证上一页 [1] [2] [3] 下一页
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