RNA干扰分化抑制因子 1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

　　2.4 流式细胞技术检测TE-1细胞的细胞周期和细胞凋亡 与转染对照组、转染试剂组相比，转染实验组处于G0/G1期的细胞和处于S期的细胞比较差别均有统计学意义(P<0.05)。Annexin/PI双染法检测结果显示，空白对照组、转染对照组和转染试剂组的凋亡率较低，而转染实验组TE-1细胞的凋亡率为7.9%(P<0.05，表4)。表4 siRNA转染对TE-1细胞周期和凋亡的影响

　　3 讨 论

　　前期已对Id-1在ESCC组织中的表达作用做过研究，证实其具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，是肿瘤发生、发展过程中的正调节蛋白[6]。而RNAi技术以其高稳定性、高效率性、高特异性及高传递性等特点，已成为肿瘤基因治疗的研究热点;靶基因的二级结构是影响siRNA沉默效率的主要因素之一，siRNA的干扰活性与其和靶基因mRNA的可结合性密切相关，针对靶基因的不同序列，siRNA的抑制作用差异很大[7-8]。

　　将根据RT-PCR结果优选出来的si-Id-1-001进一步进行转染，并检测各组蛋白的表达，从转染后Western blot的结果分析，发现转染组无Id-1蛋白表达，与对照组比较，差别具有统计学意义(P<0.05)，这与Li等的研究结果一致[9]。上述结果表明，利用脂质体人工合成的si-Id-1是可行和有效的，可能为研究Id-1对食管癌细胞生物学特性的影响及其作用机制提供一个可靠的工具。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖能力，结果显示，转染24 h后si-Id-1组细胞增殖速度明显减慢，其增殖能力均受到抑制。可见，si-Id-1的瞬时转染能显著抑制ESCC细胞的增殖速度，这一结果与Hui等的研究一致[2]。经流式细胞监测转染后TE-1细胞的细胞周期，发现转染试验组转染48 h后G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例减少，由此可以推断si-Id-1可抑制人食管癌TE-1细胞从G0/G1期进入S期，导致G0/G1期阻滞，细胞不能进入S期合成DNA，从而达到抑制细胞快速增殖的作用。细胞增殖大多是由DNA合成的开始阶段细胞周期的G1/S所控制，这是阻断细胞增殖最关键的时相，siRNA有可能在G1/S期转换的决定性“检查点”抑制了TE-1细胞的进一步增殖，与Swarbrick及Zhang等的研究一致[10-11]。采用AnnexinV/PI双染凋亡细胞检测本实验中各组细胞凋亡指数，评价siRNA瞬时转染对TE-1细胞凋亡能力的影响。本研究发现ESCC TE-1细胞经si-Id-1转染48 h后凋亡率明显增加，说明体外RNAi技术下调Id-1基因表达，并对细胞凋亡起诱导作用。

　　Id-1靶向的siRNA通过抑制TE-1细胞Id-1 mRNA和蛋白表达水平，进而抑制TE-1细胞从G0/G1期进入S期，从而抑制TE-1细胞的快速增殖，诱导其凋亡。由此可见，Id-1基因可能参与TE-1细胞的增殖和凋亡，si-Id-1可能为抑制ESCC增殖提供一种基因治疗方法。然而，应用脂质体瞬时转染存在脂质体毒性、转染效率低、基因沉默效应短暂等不足，还需要构建带筛选标记的siRNA表达质粒，进行稳定转染，以获得较长时间的基因沉默效应和更为理想的干扰效果。通过体外实验优选出来的si-Id-1-001序列还有待进一步进行体内实验，以确定其是否能通过下调ESCC细胞Id-1的表达打断ESCC恶性变的进程，实现降低ESCC恶性度甚至逆转的目标，以期为临床治愈ESCC提供新的方法和思路。

　　【参考文献】

　　[1] Mariette C,Piessen G,Triboulet J P. Therapeutic strategies in esophageal carcinoma: role of surgery and other modalities[J]. Lancet Oncol, 2007,8(6):544-553.

　　[2] Hui C M,Cheung P Y,Ling M T, et al. Id-1 promotes proliferation of p53-deficient esophageal cancer cells[J]. Int J Cancer, 2006,119(3):508-514.

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