RNA干扰分化抑制因子 1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

　　上游引物(Id1-P1)：

　　5'-CAG CAC GTC ATC GAC TAC ATC A-3'

　　下游引物(Id1-P2)：

　　5'-GAA TCC CAC CCC CTA AAG TCT C-3'

　　以β-肌动蛋白(β-actin)的一段扩增序列为内对照，扩增片段大小为556 bp。

　　上游引物(β-actin-P1)：

　　5'-AAA GAC CTG TAC GCC AAC ACAG-3'

　　下游引物(β-actin-P2)：

　　5'-TTT TAG GAT GGC AAG GGA CTT C-3'

　　反应体系：1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA模板200 ng，引物浓度0.4 μmol/L，Taq酶1.25 U，反应总体积25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，共30个循环;72 ℃最后延伸7 min。最后的PCR扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。

　　目的基因的表达指数=目的基因条带的积分密度值/内对照条带的积分密度值

　　1.3.3 Western blot法检测Id-1的蛋白表达 siRNA转染TE-1细胞60 h后以RIPA缓冲液4 ℃裂解30 min，离心，取上清并采用BCA进行蛋白定量。各组采用同样的蛋白量上样，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，封闭液封闭1 h，加Id-1抗体(1∶1 000)4 ℃过夜，洗去未结合的一抗，以Western blot试剂盒加二抗DAB染色。

　　1.3.4 转染前后ESCC细胞的增殖 siRNA转染TE-1细胞在37 ℃，体积分数为0.05的CO2的培养箱内培养，24，48和72 h分别停止孵育，并向相应的培养板孔内加入10 μg/L的CCK-8溶液10 μL，继续培养2～4 h。酶标仪在450 nm的波长条件下测定各孔吸光度值。

　　细胞生长抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值

　　1.3.5 流式细胞技术检测细胞周期和凋亡 siRNA转染TE-1细胞48 h，胰酶消化并收集各组细胞，离心，弃上清，PBS洗涤，加缓冲液使其浓度为1×106 mL-1，取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入Annexin V/FITC 5 μL和20 μg/mL的碘化丙啶溶液10 μL，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μL PBS，用WinMDI 2.9对结果进行分析处理。

　　1.4 统计学处理 每组实验均重复3次，实验数据以x±s表示，用SPSS 15.0软件分析。单因素方差分析采用q检验，以P<0.05表示差别有统计学意义。福建医科大学学报 2009年11月 第43卷第6期曾达武等：RNA干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响

　　2 结 果

　　2.1 Id-1 siRNA转染至TE-1细胞后Id-1 mRNA的表达 转染后24～48 h含绿色荧光的细胞数最多，60 h后含绿色荧光的细胞数逐渐减少，提示TE-1细胞转染时间为24～48 h(图1)。通过荧光标记FAM的阳性对照转染效率，可预测本实验siRNA的转染效率>80%。RT-PCR聚丙烯酰胺电泳及凝胶图像分析系统灰度扫描结果均提示，空白对照组、转染试剂组和转染对照组Id-1 mRNA均存在表达，但各组间差别无统计学意义;3组转染实验组Id-1 mRNA的表达水平明显降低，灰度扫描值与空白对照组比较差别有统计学意义(P<0.05,图2，表1)。3条序列在转染后48 h均发挥明显的Id-1基因的沉默效应，尤以si-Id-1-001最为明显。

　　2.2 Id-1 siRNA转染至TE-1细胞后Id-1蛋白表达水平 转染组细胞Id-1蛋白表达明显低于空白对照组、转染试剂组和转染对照组。Image-ProPlus图像分析显示：si-Id-1组细胞Id-1完全不表达，与空白对照组比较差别具有统计学意义(P<0.05)(图3，表2)。

　　2.3 CCK-8法测定Id-1 siRNA干

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