|
雌性大鼠老化过程中脾细胞雌激素受体含量及白细胞介素 |
| |
取3、7、12、15、18月龄雌性SD大鼠(由上海医科大学实验动物部提供，清洁级标准饲养)，每组5只，放血处死。血标本留测血清雌二醇浓度。取出脾脏，一部分干冰速冻，液氮保存，待测ER；另一部分作IL-2、TNF诱生(以ConA作诱生剂)，24小时后取上清液，-20℃保存，待测IL-2、TNF活性。
二、方法
1.大鼠脾细胞ER测定：采用放射配体结合分析法(羟基磷灰石吸附分离)—HAP法，主要参考Chae氏法〔8〕。取新鲜冻存大鼠脾脏，去除周围脂肪和结缔组织，称重，剪碎，按1:6(重量：体积)加入冰冷抽提液TGM(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.5,10%Glycerol,3mmol/L MgCl2,1.5mmol/L EDTA,20 mmol/L Na2MoO4,1mmol/L PMSF及0.4mol/L KCl)，高速分散器匀浆，匀浆液于1小时后在4℃ 17000g离心40分钟，取上清液，测定蛋白浓度，进行3H-雌二醇与受体的单点饱和结合分析以比较细胞ER受体数的多少。在200μl反应体系中，加入600μg蛋白抽提液及饱和浓度的3H-雌二醇(15nmol/L)，(饱和浓度根据Scatchard作图而定，据Scatchard作图，Kd=0.36nmol/L;3H-雌二醇为中科院上海原子核所产品，放射性比强度73ci/mmol，放化纯度＞95%)，测定非特异性结合量另加200倍3H-雌二醇量的己烯雌酚，置4℃18小时，再置冰浴10分钟，加60%HAP 0.3ml，置冰浴15分钟，用冰冷洗脱缓冲液抽滤，每次5ml，共3次，烘干膜上HAP，放入5ml闪烁液中，FJ-2105型液闪计数仪上计数得cpm值。总结合管cpm减去非特异性结合管cpm，得特异结合cpm，换算成每毫克蛋白(pro)中ER的fmol数。为使实验结果更具可靠性，每个标本测定均设三复管，取其平均数。将同一样品分成4份，同时测定3H-雌二醇的特异结合量，平行管间的变异系数为6.4%。
2.大鼠血清E2浓度测定：由上海市内分泌研究所按放射免疫法常规方法测定。大鼠雌二醇放免药盒由世界卫生组织提供。
3.IL-2的活性测定：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，参照Mossman检测法〔9〕改进。收集生长良好CTLL-2细胞(由中科院上海细胞生物学研究所提供)，用RPMI 1640液制成浓度为1×105/ml的细胞悬液。倍比稀释标准品及待测样品，加每孔100μl入96孔平底细胞培养板，每孔加100μl上述细胞悬液，另设4个对照孔，只加100μl细胞悬液和100μl培养液。37℃5%CO2培养36小时，每孔加MTT溶液(5mg/ml PBS)10μl，震荡1分钟，37℃孵育4小时，各孔加100μl酸化异丙醇(0.04mol/L HCL)，混匀，置数分钟，测定OD值，将待测样品的OD值与标准品OD值比较后求得待测样品的IL-2活性。
4.TNF的活性测定：采用细胞毒法，参照Krammer检测法〔10〕改进，详法参见文献〔11〕。
5.统计学处理：实验数据采用±s表达，数据处理采用t检验及方差分析。
表1 雌性SD大鼠各不同月龄组血清E2浓度、脾细胞ER水平及IL-2、TNF活性的比较(±s)
Tab 1 Serum E2, splenic ER, IL-2 and TNF in female SD rats of different ages
月龄
Age(month) 鼠数
Number E2
(pmol/L) ER
(fmol/mg) IL-2
(U/ml) TNF
(U/ml)
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 大黄酸对体外培养小鼠肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达及葡萄糖摄入的影响
下一个医学论文： 苯那普利对糖尿病大鼠肾皮质p21CIP1蛋白表达的调节及其机制
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文