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从猪脑中提取纯化谷氨酸脱羧酶的研究 |
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ET)均为Sigma公司产品。羟基磷灰石为华美生物工程公司产品。DEAE-Sephacel为瑞典Pharmacia公司产品。
二、方法
1.GAD鉴定方法：(1)SDS-PAGE测定分子量：采用Laemmli法，4%的浓缩胶和10%的分离胶。抗原溶液加入等体积的样品缓冲液(10mmol/L pH 7.2磷酸钠缓冲液，5% β-巯基乙醇，1%SDS)，煮沸3分钟，样品加入到1mm厚凝胶样品槽中，以10mA恒流条件下电泳5小时。(2)GAD酶活性分析：酶反应按文献〔4〕改良进行，10μl 40mmol/L 谷氨酸( 含0.1μCi L-1-14C-谷氨酸)于自制反应试管中〔5〕，加入90μl酶溶液，于37℃反应30分钟，加20μl 1mol/L H2SO4终止反应，并继续在37℃下保温1小时，使产生的14CO2完全释放并吸附到涂有海胺(Sigma)的滤纸片上，待反应完成，取出滤纸片于测量瓶加3ml闪烁液(Hisafe Pharmacia)，用液闪计数仪(Wallac 1409， Pharmacia)测定cpm值。(3)蛋白含量分析：采用考马斯亮兰比色法。
2.GAD纯化步骤：(1)制备GAD粗制品：猪6只，宰杀后立即取出全部脑组织，去除脑干，剪成极小的组织块，加入10倍体积的标准缓冲液(含50mmol/L磷酸钾，0.2mmol/L PLP，1.0 mmol/L AET, pH 7.2)，4℃条件下高速匀浆机匀浆，130000×g离心60分钟，取上清作为GAD粗制品，用于进一步纯化。(2)硫酸铵盐析：取GAD粗制品，逐步加入27%饱和硫酸铵溶液，同时加入0.1 mol/L NH4OH使pH值保持在7.2左右。混匀15～20分钟，4℃条件下130000×g离心30分钟，取上清加入62%饱和硫酸铵溶液，同时加入0.1 mol/L NH4OH使pH值保持在7.2左右。沉淀溶于标准缓冲液，并用标准缓冲液透析硫酸铵。(3)Sephadex G100凝胶柱层析：Sephadex G100凝胶柱体积4.0×60cm，加入40ml(约1000mg蛋白量)盐析后的GAD粗制品。用标准缓冲液洗脱，流速25ml/hr，分部收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物(将洗脱物装入透析袋中，置透析袋于平的表面上，将聚乙二醇20 000干粉撒于其上，至浓缩到所需的体积)。SDS-PAGE测定分子量。取相对分子质量64000条带明显的收集物，硫酸铵盐析，取30%～68%硫酸铵盐析蛋白，测定GAD酶活性，并作进一步纯化。(4)DEAE-Sephacel凝胶柱层析：DEAE-Sephacel凝胶柱体积2.5cm×50cm，加入20ml经(3)纯化后的GAD溶液。用标准缓冲液洗脱，丢弃洗脱物。再用150mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.2 mmol PLP,1.0mmol/L AET,pH 7.2)洗脱，收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物，SDS-PAGE测定分子量。硫酸铵盐析，取33%～70%硫酸铵盐析蛋白，测定GAD酶活性，并作进一步纯化。(5)羟基磷灰石凝胶柱层析：羟基磷灰石凝胶柱体积2.5cm×50cm，加入20ml经(4)纯化后的GAD溶液。用标准缓冲液洗脱，用25mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱，丢弃洗脱物。再用标准缓冲液和75、150mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱，分别收集洗脱蛋白。渗透压法浓缩洗脱物，SDS-PAGE测定分子量。测定GAD酶活性。
结 果
GAD粗制品经Sephadex G100凝胶柱层析产生两个蛋白峰，结果如图1。第一峰为穿透峰，第二峰为排阻峰。
第二峰分部收集后SDS-PAGE结果如图2。排阻峰管号35、40、45的64000蛋白条带最为明显。取35～45管洗脱物混匀后作进一步纯化。
经2(3)纯化后的GAD溶液再经DEAE-Sepha-cel凝胶柱层析，收集洗脱物，SDS-PAGE结果如图3。
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