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nm23 |
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低分化6例。上述组织标本当离体后新鲜收集，并迅速放置于-80℃低温柜中保存备用。
二、试剂
nm23-H1探针为100 bp Bam H1限制脱氧核糖核酸(DNA)内切核酸酶片段，由人体βm-23基
因克隆而成的pNM23-H1质粒。对照探针用a-32P标记的人7S互补DNA(cDNA)克隆。其他试
验用的十二烷基肌氨酸、马来酸、甲酰胺及琼脂糖等有关试剂均由瑞士泊尔尼大学提供。
三、Northern blot分析
取结肠癌组织标本经超声粉碎制成匀浆，按Guillem等人［4］的一步法提取核糖核酸
(RNA)，260/280 nm A值＞1.8。提取的RNA经65℃变性，在1.2%琼脂糖、1.8 mol/L福尔
马林凝胶中电泳2.5小时后，将凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，紫外线照射作交联固定。把此
膜置预杂交液［50%甲酰胺，5×氯化钠、柠檬酸钠溶液(SSC)，2%阻断液，0.1% N-十二烷基
肌氨酸和0.02% SDS］和60℃杂交液(加入地高辛标记的反义nm23-H1 50 μg/L)中，分别
为1小时及过夜。用65℃的0.1×SSC和0.19% SDS液洗3次，每次15分钟。置20 ml的阻断液中
孵育30分钟，加入1 μl抗地高辛抗体(1∶20 000)30分钟后，用马来酸缓冲液洗3次，每次
15分钟。最后加入25 mmol/L CDP-Star，X线片室温下曝光15～50秒。然后用影像密度
仪(Bio-Rad 620)对X线片上的显像带作定量测定。
为了评价样品上样量，用α-32P标记7S cDNA探针与预杂交液及杂交液孵育，杂交温度
为42℃，变性温度100℃，2×SSC和0.2×SSC液各洗2次，X线片置-80℃曝光4～8小时。
四、统计学分析
实验结果用卡方检验进行。
结果
一、nm23-H1基因在不同组织中的水平
10例正常结肠组织，6例结肠息肉及20例结肠癌组织中的nm23-H1 mRNA的表达测定结果
是，正常组织的表达水平较低，其杂交信号很弱，有的几乎无杂交信号出现。与正常组织比
较，结肠癌组织中的nm23-H1基因显示出较高的水平，各杂交信号明显，带型清楚。
二、Northern blot结果的密度检测值
正常结肠组织、结肠息肉和结肠癌三种不同组织的Northern blot结果，经影像密度
检测分析仪测定的检测值分别为0.06～0.21，0.13～0.98和1.50～10.70。结肠癌与正常
结肠组织比较差异有非常显著性，P＜0.001。6例结肠息肉中有4例明显高于正常结肠组织，
P＜0.05。
三、与临床资料及病理学的关系
nm23-H1 mRNA基因在原发性结肠癌中的水平与临床有关资料的关系见附表。从附表
中可见，nm23-H1 mRNA与病人的性别(P=0.73)、年龄(P=0.61)和肿瘤的分化程度(P=0.89)无
明显关系，而与肿瘤的大小(P＜0.05)及肿瘤的分期(P＜0.025)有显著性的相关。
讨论
nm23-H1基因是最初从小鼠黑色素瘤K-1735细胞系中分离得到的cDNA克隆［1］。该基因
产物nm23-H1蛋白的功能可能是通过二磷酸核苷激酶而实现的。据文献［5］报道，该基
因的低表达与乳腺癌、黑色素瘤及肝细胞癌等的转移潜能有关。
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