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长期生存急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病变的测定 |
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尖杉酯碱(H)2～4 mg/d，连用5～7天，阿糖胞苷(A)100～200 mg/d，
连用5～7天；或DA方案：柔红霉素(D)为40～60 mg/d，连用2～3天，阿糖胞苷
(A)100～200 mg/d，连用5～7天，进行缓解后治疗。缓解期患者治疗的基本方案
是：ATRA与化疗交替使用或单用化疗。其中3例患者在获得CR 4个月到两年内进行
了自体骨髓移植。PCR检测时DFI为60～85个月，跟踪时间为77～107个月。10例病
人其他一般情况见附表。表中例4、5、7、9、10在做PCR同时亦做染色体核型分析，
均示正常核型。
方法：(1)以上患者骨髓单个核细胞用Ficoll方法进行分离，保存于液氮中。
(2)RNA抽提：用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法抽提。(3)二步法RT/PCR检测PML-RARα mRNA。
逆转录反应：在40 μl体积中进行，包括总RNA 1 μg，六随机引物(promega)100 ng，
AMV逆转录酶(promega)10 U。反应条件为42℃、30分钟。筑巢式PCR反应：根据文献［5］
修改而成。反应体积为100 μl，包括逆转录反应产物10 μl，寡核苷酸引物各为150 pmol，
dNTP浓度各为200 mmol/L、10 mmol/L)，pH 8.4，MgCl2 1.5 mmol/L，BSA 20 mg/L，
KCl 50 mmol/L，Taq多聚酶2.5 U(Sangon)。扩增条件：变性，94℃，45秒；退火，55℃，
1分钟；延伸，72℃，90秒，每一轮反应为30周期，但第一周期变性条件为95℃，5分钟，
而在最后一周期延伸时间增至72℃，10分钟。第二轮反应的模板为第一轮反应的产物
(10 μl)。每次实验均作阴、阳性对照及空白对照。阳性对照为NB4细胞。所有标本均
用β-actin做内对照，产物为304 bp。(4)PCR产物分析：取10 μl PCR产物，在1.5%琼
脂糖凝胶中进行电泳，用溴乙锭(1 μg/μl)染色，照相。
附表 连续缓解大于5年患者的基本情况与PCR结果
例号 性别 年龄
(岁)
诊断 CR后
治疗方法 CCR时间
(月) PCR结果
(S/L型) 跟踪时间(月)
1
男 34 M3a
ABMT 61 - 81
2 女 42 M3a 化疗 76 - 98
3 女 44 M3b ABMT 84 - 104
4 男 43 M3b 化疗 85 - 107
5 女 48 M3a 化疗 78 - 100
6 女 45 M3b 化疗 67 - 86
7 女 38 M3b 化疗 62 - 84
8 女 32 M3a ABMT 60 - 77
9 女 45 M3a 化疗 60 - 86
10 女 37 M3b 化疗 65 - 82
注：CCR：连续完全缓解；CR：完全缓解；ABMT：自体骨髓移植；现况均为
完全缓解
结果
1.敏感度测定：将5×106 NB4细胞按1∶9比例梯度稀释于HL-60细胞中，分别
进行PCR检测，表明该实验敏感度相当于104～105个正常细胞中可检出一个APL细
胞。考虑到RNA质量与PCR效果等问题，同时用β-actin做内对照。
2.完全缓解情况：10例完全缓解大于5年的患者不仅形态学证实仍然继续缓
解，5例染色体核型也正常，其RT-PCR检测均获阴性结果。随访8～10个月仍处
缓解中。这个结果与我们同时检测的13例完全缓解小于3年的病人中7例仍为阳性，
两者间差异有显著性。
讨论
目前，常用于临床检测白血病患者中MRD的RT-PCR方法，主要针对慢性粒细
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