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重型乙型肝炎肝内细胞间粘附分子 |
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外事故死亡者，血清HBsAg、 丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、HBV DNA、HCV RNA均阴性，常规病理检查显示均为正常肝 组织。
二、试剂
两条寡核苷酸(ODN)由中国科学院上海生物化学研究所合成，其中一条ODN1序列为5′-GG GACCCATAGC GAGGCTGAGGTTGCAA-3′，与ICAM-1 mRNA 5′末端翻译起始位点序列(nt63～81)互补，另 一条ODN2序列与ODN1互补；ODN3′末端地高辛(DIG)标记试剂盒，碱性磷酸标记的抗地 高辛抗体(抗-DIG-AP)和NBT/BCIP显色液由德国宝灵曼公司提供；杂交液含50%去离子甲酰 胺、5×SSC、5×Denhardt s液、0.25%SDS、100 μg/ml变性鲑精DNA和10%硫酸葡聚糖。
三、方法
(一) 标本保存及切片制备 每例肝组织分成2份，1份用10%甲醛溶液固定制成石蜡切片作常 规病理检查；另1份用去RNA酶的过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛(PLP)溶液固定、去RNA酶的8. 5%蔗糖/PBS溶液漂洗后置液氮中保存，并制成5 μm厚的冰冻切片。
(二) 制备DIG标记的ICAM-1寡核苷酸探针 按试剂盒说明书提供的方法对ODN1 和ODN2进行3′末端标记，各获得100 pmol(1 400 ng)的探针，其中DIG标记的ODN 1为检测ICAM-1 mRNA的探针。
(三) 原位杂交检测肝组织ICAM mRNA 为避免肝组织的mRNA被降解，实验过程中的全部试剂 均用去RNA酶的DEPC水配制，全部器材均经去RNA酶处理。按照《非放射性杂交技术》介绍的 方法，稍加修改后进行，主要步骤如下：(1) 肝组织冰冻切片自然风干后，4%多聚甲醛/PBS 溶液固定15 min，蛋白酶K(5 μg/ml)消化15 min，0.1 mol甘氨酸/PBS处理5 min，4%多聚 甲醛/PBS溶液固定10 min，PBS溶液漂洗5 min×3次，2×SSC溶液漂洗15 min;(2) 将杂交液 在100°C加温10 min，将制备的探针用杂交液稀释20倍，将含有ICAM-1探针的杂交液 滴加 在切片上，放入湿盒37°C杂交24 h；(3) 系列SSC溶液漂洗；(4) 用封闭试剂封闭后加 入抗 -DIG-AP,4°C 16 h;(5) 用1号(100 min Tris-HCl, pH 7.5, 150 mol NaCl)和3号(100 mol Tris-HCl, pH 9.5, 100 mol NaCl, 50 mmol MgCl2) DIG缓冲液漂洗后加NBT/BCIP 溶 液显色，光镜下见紫色颗粒为阳性，肝细胞ICAM-1 mRNA表达强度分级参照Chu等提出 的标 准：肝细胞不着色为-，肝细胞着色<10%为+，10%～50%为++,>50%为+++。对照设置：不 加探针为阴性对照，加DIG标记的ODN2为特异对照。避免ICAM-1探针与ICAM-1基因组DNA 杂交出 现假阳性结果，实验中未对组织切片进行高温变性处理。
四、统计学方法
用秩和检验。
结 果
一、ICAM-1 mRNA表达
正常人和AsC肝组织内，肝窦内皮，枯否细胞和血管内皮细胞有少量ICAM-1 mRNA表达，肝 细胞无ICAM-1 mRNA表达。在慢性和重型乙型肝炎，肝细胞出现不同程度ICAM-1 mRNA表达 ，且肝窦内皮、血管内皮细胞ICAM-1 mRNA表达增强。阳性表达位于胞浆中，少数伴有核着 色。在慢性乙型肝炎，ICAM-1 mRNA阳性肝细胞多呈散在分布；在重型乙型肝炎，肝细 胞呈大片状坏死或桥形坏死，残存肝细胞和再生肝细胞大量表达ICAM-1 mRNA。
二、肝细胞ICAM-1 mRNA表达水平
重型肝炎患者肝细胞ICAM-1 mRNA表达显著强于慢性肝炎、AsC和正常人，P<0.01(表1) 。
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