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子宫内传播中乙型肝炎病毒部分S区基因的变异 |
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HBV标志 HBsAg, 抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc用ELISA检测。
(二) 各种标本的处理及DNA的抽提 抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞，PBS反复洗 涤以除去血液中HBV的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2 g与PBS 2 ml在 无 菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤，加PBS 2 ml后分小包装低温保存备用；精液标本离心 将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV的影响，恢复体积分小包装低温保 存备用。上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性。各种细胞标本及血清标本提取DNA ［4］。
(三) HBV DNA检测 PCR引物合成于中国科学院上海细胞生物学研究所。引物取自HBV S区( 表1)。外引物为S 1R、BS1，扩增片段为787bp。内引物为S3、BS3，扩增片段为261bp。第一轮PCR产物1∶50稀 释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。常规PCR方法参考文献[ HT]［4］。阳性标本以斑点杂交法确认，操作按说明书。
表1 PCR引物序列
引物 位置 序 列
S1R 842～822 5′ TTAGGGTTTAAATGTATACCC 3′
BS1 56～76 CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC
S3 427～448 CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG
BS3 687～668 GGCACTAGTAAACTGAGCCA
(四) 序列分析 取第二轮PCR产物以醋酸胺与异丙醇纯化，用Fmol DNA cycle sequenc ing system (promega公司)以双脱氧链末端终止法测序［4］，γ-32P- A TP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序 列(genebank)比较。
结 果
4例女性HBV携带者HBsAg、HBeAg均阳性。6例男性携带者中4例HBsAg、HBeAg阳性，2 例HBsAg 、抗-HBe阳性。10例胎儿仅2例HBsAg阳性。以套式-PCR(Nested-PCR)检测HBV DNA 6 2份标本阳性58份，其 中10份父、母亲血清、3份父母亲白细胞、2份胎儿血清、2份胎儿白细胞、2份胎儿肝脏、2 份精液、为第一轮PCR阳性，其余63.8%(37/58)均是第二轮PCR检测时出现阳性结果。尤其是 精子标本在第一轮均阴性。5例对照胎儿与父母各种标本均无HBV感染标志。
以PCR产物直接测定10例携带者与胎儿的HBV S基因第451～660位核苷酸(从HBV的EcoR1酶切 点计算)。4对母儿、6对父儿此段序列核苷酸同源性均在98%～100%。4对母儿中2例胎儿的此 段序列与母亲完全一致。另外2例在个别碱基上有变。第1对544、546位碱基母亲为A、C，胎 儿为C、A。值得注意的是胎儿的C(A)、A(C)位置上信号较弱的平行带。此外581、586位母亲 为A、C，胎儿为T、T。第4对544、546位的变化与第1对相同。544与586位的变异均为无表型 变异。546的变异使S区第131位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基 酸由苏氨酸变为丝氨酸。此段序列中4对母儿共同变异的有3个位点，499、529、530位，仅 第3对母儿在530位由A变为G致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸。其它均为无表型变异 。6对父儿中第3、4、5、6例胎儿的此段序列与父亲完全一致，其中第4对父亲血清、精子与 胎儿血清HBV基因两个位置均与原型株有差异，第499、508位原型株为C，此对父儿为A、G， 此变异未引起表型变化。第1例胎儿8个位点与父亲不同，491、494、505、544、546、581、 586、592位碱基父亲为T、T、C、A、C、A、C、C，胎儿为A、A、T、C、A、T、T、T。第2例 胎儿544、546位的变化与第1例相同。在这2个位点上也有信号较弱的平行带。上述位点中49 1、494位的变异使胎儿S区第113、114位氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸，546位的变异使131位 氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸，其它位 点均为无表型变异。此段序列中父儿共同变异的5个位点即493、499、508、529及530。其中 仅第3对父儿在530位由A变G，致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸。
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