迷走神经刺激对红藻氨酸致癫痫大鼠孤束核内谷氨酸受体和 氨基丁酸受体的影响

　　【Key words】　Epilepsy; Receptors, glutamate; Receptor, GABAA; Vagus nerve; Kainic acid

　　近年来，迷走神经刺激(vagus nerve stimulation，VNS)作为一种非药物抗癫痫治疗方法倍受关注，大量的动物实验及临床结果已证实,VNS具有明确的抗癫痫效果［1,2］,但其机制尚不清楚。有学者观察到，孤束核等结构与VNS的抗癫痫作用有关［3］；还有学者观察到，VNS可使红藻氨酸(kainate，KA)致癫痫大鼠海马和齿状回内N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体1亚型阳性细胞数量减少［4］。孤束核是迷走神经进入中枢后的终止部位，但VNS对孤束核内谷氨酸受体（GluR）和γ-氨基丁酸（GABA）受体的影响尚未见报道。为了阐明KA致癫痫和VNS抗癫痫的作用机制，我们采用免疫组织化学染色技术，观察了VNS对KA致癫痫大鼠孤束核内GluR5和GABAA受体免疫组化反应阳性结构的影响，进一步探讨KA致癫痫和VNS抗癫痫的作用机制及其与GluR和GABA受体的关系。

　　材料和方法

　　1. 动物：实验用雄性SD大鼠24只，体重190～250 g，将动物随机分成KA组、 VNS+KA组和对照组,每组8只鼠。

　　2. KA组鼠的处理：腹腔注射KA(8 mg/kg)制成癫痫发作模型，癫痫模型的成功与否以其发作时的行为变化为主要指征。

　　3. VNS+KA组鼠的处理：将乌拉坦(800 mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，手术分离颈左侧迷走神经，连接刺激电极。待大鼠清醒后，行迷走神经刺激。刺激参数：输出电流1.5 mA,频率30 Hz，波宽0.5 ms，刺激时间30 s，间隔5 min。然后，按KA组方法制备癫痫模型鼠，再继续进行VNS，重复10次，观察其行为变化。

　　4. 对照组动物的处理：腹腔注射与KA液等量的生理盐水，手术分离出颈部左侧迷走神经，但不对其进行刺激。

　　5. 取材：（1）KA组：癫痫模型制成后，观察2 h，记录癫痫发作次数。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸，经左心室插管，先用0.9%生理盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH7.3)灌注固定。灌注完毕立即取脑并置入上述新鲜固定液中后固定4～6 h，再移入含30%蔗糖的PB中至沉底(4℃)。（2）VNS+KA组：待癫痫模型鼠发作次数减少≥50%后取材，方法同上。（3）对照组：与VNS组取材时间相当，方法同上。

　　6. 免疫组化染色：冰冻横切延髓尾段，片厚30 μm，切片隔4张取1张，分5套收集。按ABC法进行免疫组化染色，每套切片孵育抗体量均为0.5 ml。(1)第1、2套切片分别入兔抗GluR5(UBI)和小鼠抗GABAA受体β亚单位(GABAARβ)血清，孵育24 h；(2)切片分别入Biotin标记的驴抗兔IgG(Chemicon)或Biotin标记的驴抗小鼠IgG(Jackson)，孵育4 h；(3)切片均放入Avidin-HRP复合物(Vector)中孵育2 h；(4)放入含二甲基联苯胺(DAB)8 mg和0.001%的H2O2的0.05 mol/L trisHCl缓冲液40 ml中呈色。第1抗体和第2抗体的浓度为1 mg/L和10 mg/L，Avidin-HRP复合物的浓度均为5 mg/L，抗体和复合物的稀释均用含2%正常马血清和0.3%Triton×100的0.01 mol/L PBS。上述孵育均在室温下进行，各步骤之间均用PBS清洗切片。对照实验用正常兔血清或正常小鼠血清代替第1抗体孵育第3、4套切片，其余的染色步骤同上。第5套切片用Nissl染色,以便对照观察和定位免疫组化染色的阳性结果。

　　7. 结果分析和统计学处理：各组动物中，每只大鼠均随机选取6张切片，在明视野下计数双侧孤束核内

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] 下一页