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新疆地区动脉血栓形成患者抗活化蛋白C及F Leiden 突变的调查 |
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eden) 在Sysmex AC7000 (日本)血液凝固仪上检测，即用50 μl 的待检血浆与等量的aPTT试剂， 分别测得加和不加活化蛋白C(APC) 的aPTT，重复上述试验取其均值，并计算加入APC 前后之APCSR。计算正常化APCR 敏感性比率(nAPCRSR) ,即nAPCRSR = 被检者APCRSR/ 正常混合血浆APCRSR。
1.4 因子 FⅤ Leiden 分析 按Bertina[2]等的方法。多聚酶链反应扩增凝血因子第10 外显子片断，再用限制性内切酶 MnLI (Biolabs)消化，2% 琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察结果。仪器:PCR 热循环仪( PE480)、电泳仪、电泳装置、紫外检测仪。试剂:细胞膜裂解液、细胞核裂解液(pH 8.2)、10×PCR 缓冲10×酶解缓冲液 buffer2、TE 缓冲液、Tag DNA 聚合酶、dNTPs、Marker以及引物购自上海申能博彩公司，限制性核酸内切酶 MnlⅠ购自生工公司，蛋白酶E购自Sigma公司。用以扩增正常或突变等位基因的序列特异性引物如下表。扩增片断为 267 bp。
表1 FⅤ基因检测聚合酶链式反应序列APC裂FⅤ肽键位点 FⅤ外显子 引物序列Arg 306 The 7 5’TCT TGC CTT TTC TGG ATG C3’ 519bp BstNⅠArg 306 Gly 5’TTT GGT GAT TTG GGG GTA A3’ MspⅠArg 506 Gln 10 5’ATT GGT TCC AGC GAA AGC3’ 386bp MnIⅠ 5’CCA TTAT TTA GCC AGG AGA CC3’
1.5 凝血酶原基因 G20210A 的检测 根据Poort[3]的方法，用聚合酶链反应(PCR),扩增含有PT基因 G20210A 变异的DNA片断，上游引物5’TCT AGA AAC AGT TGC CTG GC3’(1988919908),下游引物为5’ATA GCA CTG GGA TTG AAG C3’(2023320212)。PCR产物纯化后，加入Hilld Ⅲ 内切酶酶切，消化片断在1％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色后，紫外灯下观察结果。
1.6 统计学处理 采用SPSS 12.0统计学软件上机分析。计量资料正态分布以均数±标准差(x±s)描述 ，多个组间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。定性检测指标以阳性率(%)表示。
2 结 果
2.1 一般检查项目的比较 3组的 aPTT 的检测值比较无差别，脑梗死组的aPTT 1（加入APC的aPTT值）与正常人组比较高，差异有统计学意义（P=0.001）。表2 脑梗塞组和心肌梗死组与正常人组APCR 等一般项目的比较
2.2 参考Seven sson等的评定标准&上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页
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