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新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究 |
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CⅡ+、CD 34-、CD 8-（共8次，统计结果见表1）。将改良后的方法与原方法进行对比发现，新方法培养所得到的原代及传代细胞纯度均较高，活性较好对比分析结果见表2。表1 流式细胞仪结果统计分析表表2 流式细胞仪结果比较表
3 讨 论
有学者实验证明成年心脏内确实存在着具有多向分化潜能的干细胞[39]。他们所发现的心肌干细胞都具有以下基本特征：① 缺乏血细胞系、 骨髓造血干细胞、内皮祖细胞、成熟内皮细胞表型；② 具有克隆形成能力及自我更新能力；③ 可表达一系列心肌转录基因（GATA4， MEF2C，TEF1），但不表达心肌结构基因（MHC ，MLC2a，MLC 2v，CTnT等）；④ 不仅能在体外分化成可搏动的心肌细胞，而且将其注入心肌梗死区后也能在体内分化成心肌细胞，改善心脏功能，缩小梗死面积。我实验组已经从新生大鼠心肌组织中成功分离培养得到原代心肌干细胞，经流式细胞仪鉴定其表型为ckit＋、CD 31＋、CD 34-、CD 45-、CTnT-，细胞经传代并使用含CT－1，凝血酶等成份的培养液培养2周后，单个细胞开始出现搏动，亦可见成团细胞的同步收缩。再次流式鉴定的结果，表型有所改变ckit＋、CD 31－、CD 34－、CD 45－、CTnT＋。同时，免疫组化证实，细胞内有心肌细胞结构蛋白表达（CTnT）[10]。
实验结果初步证实了心肌中成体干细胞的存在性。我们将原来使用的方法与改良后的方法进行比较，以前所使用的方法中仅仅是用眼科剪刀将大鼠心肌组织剪碎至0.5～1 mm3，此时的组织块仍然肉眼可见，同时将组织块用培养液润洗后，必须要等待组织块贴壁之后才能再添加培养液，而加入培养液后，已经贴壁的组织块又很容易再漂浮起来，使得贴壁的心肌组织相对比较少，而从周围爬出的细胞就更少了。经过不断的观察和实验，现在所采用改良后的方法是在用剪刀将大鼠组织块剪碎的基础上，经过胰酶消化后，再使用胶头滴管进行反复吹打、高速离心后，再加入培养液重悬后进行培养。经过上述方法处理的心肌组织块更小、更易贴壁，加入培养液后成为匀浆状，一般24 h后微小的组织块即可贴壁并可见从周围爬出细胞。实验将同一批培养的原代细胞，分别采用上述两种方法后，对其进行流式细胞仪鉴定分析，结果表面改良后的组织块培养法能够分离得到密度较大、纯度较高的ckit+ 、sca1+干细胞群，而且将两组细胞分别进行传代后，再进行鉴定，所得到的带有心肌结构蛋白MHC Ⅱ 标记的心肌细胞数量明显增多，同时活性也较高。由于各家报道的心肌干细胞分离与鉴定的方法与标记物的不同，我们采用众所周知的细胞表面标记来证明培养所得到的细胞。CD 34被认为是最重要的造血干细胞标记物, CD 8为成熟T淋巴细胞表面标记，而ckit为酪氨酸激酶受体，sca1是干细胞抗原1，分子质量为18 ku心磷脂酰肌醇锚定蛋白，Ly6抗原家族的一员，表达在多能造血干细胞(HSCs)上，MHCⅡ可标记心肌结构蛋白肌球蛋白重链。本实验选取以上标记物对培养所得的原代以及传代细胞进行检测、鉴定。实验采用免疫荧光检测到该类原代细胞表面表达目前比较公认的干细胞标记(ckit 、sca1)，经传代培养约一周左右的细胞，干细胞标记(ckit 、sca1)逐渐消失，心肌结构蛋白肌球蛋白重链(MHCⅡ)开始表达。流式细胞仪结果分析可见，原代与传代培养的细胞均基本不表达CD 34、CD 8，排除该类细胞是造血干细胞、成熟内皮细胞的可能性。而早期培养的原代细胞中带有ckit、sca1标记的细胞含量较高，带有MHCⅡ标记的细胞很少，表明原代细胞中干细胞数量较多、较纯，而心肌细胞含量很少。经过传代后的细胞中带有ckit、sca1标记的细胞含量很少，而大部分细胞都带有心肌结构蛋白MHCⅡ标记，同时可出现同步搏动，说明传代后的细胞多为心肌细胞，并且此时的干细胞数量很少。综上所述，实验早期培养得到的原代细胞缺乏血细胞系、造血干细胞、成熟内皮细胞的表面标记CD 34、CD 8，不表达心肌结构基因MHC Ⅱ，而经过传代培养1周之后，开始表达MHCⅡ心肌结构蛋白，并出现心肌样搏动。因此推断该原代细胞很可能是心肌干细胞，其能够经过诱导分化为心肌细胞。实验充分说上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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