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新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究 |
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，加入TrypsinEDTA(0.25% tryspsin，1mM EDTA·4Na)于37oC消化约4 min，镜下可见细胞收缩变圆，立即加入少量CEM培养液终止反应。反复用吸管吸取瓶底液体轻轻吹打培养瓶壁，使贴壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液移至离心管，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，得到传代后的细胞。将收集到的细胞用CGM培养液继续培养（成份：35% IMDM/65% DMEMHam’s F12，2% B27，10 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF，40 nmol/L cardiotrophin1，40 nmol/L thrombin，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇），每2～3 d换液1次。
1.3 免疫荧光法检测细胞 细胞原代或传代培养约1周左右，可采用前述方法制成细胞悬液，将细胞悬液移入24孔培养板加入培养液静置过夜，于倒置显微镜下观察细胞完全贴壁，弃去培养液，DPBS冲洗，滴加经稀释至染色效价如1∶8或1∶16的荧光抗体FITC antimouse sca1、PE antimouse CD 117 、PE Cy5 antimouse MHC class Ⅱ，在37℃染色45～60 min，DPBS震荡洗涤3次，蒸馏水震荡洗涤2次，滴加4%多聚甲醛固定，于共聚焦显微镜下观察细胞。
1.4 流式细胞仪鉴定细胞 组织块培养进行约1周左右，见细胞生长良好，可采用前述方法制成细胞悬液，取细胞悬液，台盼蓝染色后于细胞计数板上计数活细胞数，调整细胞浓度至106个/L，送流式鉴定。同时，选取传代时间约1周的细胞，同样配制成浓度为106个/L细胞悬液，送流式鉴定。鉴定的主要表面标志物有ckit (CD 117) 、sca1、CD 34、CD 8、MHCⅡ。所有标本及相应抗体均送至中山二院流式细胞室进行鉴定。
1.5 统计学处理 原代及传代培养的细胞经过流式细胞仪鉴定后，共进行8次，所得到的数据采用SPSS 11.0软件包进行统计学处理，表1使用的是配对样本的t检验，比较原代细胞与传代细胞表面标记物的差异；表2使用的是两样本的t检验，比较同一批培养的原代和传代细胞，分别使用原方法与改良后的方法，所得到的表面标记物的差异，以P＜0.05为有统计学意义。
2 实验结果
2.1 共聚焦显微镜下免疫荧光细胞图像 免疫荧光染色证实，原代细胞表面带有sca1和ckit标记（图1，A为多数带有sca1标记的绿色荧光；B为多数带有ckit标记的红色荧光）。而大部分传代细胞表面并不带有sca1和ckit标记（图2，A为极少带有sca1标记的绿色荧光；B极少带有ckit标记的红色荧光）。传代细胞内带有MHCⅡ标记（图3为细胞内可见带有MHCⅡ标记的红色荧光）。
2.2 流式细胞仪结果分析图 对比研究传代细胞前后细胞表型的改变，检测的细胞标记有CD 34、CD 8、ckit、sca1、MHCⅡ。图1中A、B分别为原代细胞在流式细胞仪中ckit、sca1、MHCⅡ标志的表达图。图2中A、B分别为传代细胞在流式细胞仪中ckit、sca1、MHCⅡ标志的表达图。
2.3 统计结果分析 流式细胞仪结果图分析显示，原代细胞的表面标记为ckit+、sca1+、MHCⅡ-、CD 34-、CD 8-，经过传代培养之后，细胞表面标记变为ckit-、sca1-、MH上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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