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新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究 |
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【摘要】 目的 了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法 在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果 采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ckit、sca1阳性的细胞，表面不表达CD 34、CD 8、肌球蛋白重链(MHCⅡ)。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ckit、sca1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD 34、CD 8。结论 在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为ckit+、sca1+、CD 34-、CD 8-、MHCⅡ，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为ckit-、sca1-、CD 34-、CD 8-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。
【关键词】 心肌干细胞； 心肌再生； 心肌缺血
以往的观念认为，成年心脏属于终末分化器官。一旦心脏受到损伤，将无法通过自身细胞的再生获得完全的修复，而只能通过肥大等重构方式代偿。而随着PCNA, Ki 67, Brd U等与增殖相关的抗原、标记物的应用，实验证明心肌细胞存在有丝分裂，且在心肌缺血、坏死、心衰等情况下，细胞增殖活跃。提示心脏内也可能存在着心肌干细胞[1,2]。成体心脏内存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞，即成体心肌干细胞（cardiac stem cells， CSCs）是存在于发育成熟机体心脏组织中的具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞。但是，由于目前还不能从形态上识别心脏本身来源的干细胞,对其的鉴定、分离纯化只能通过其表面标志进行。本实验通过从小鼠心肌中分离培养出心肌干细胞，并对其表型进行鉴定、分析。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂 购自广东省实验动物中心的昆明小鼠（雄鼠4只，雌鼠16只）。于动物房饲养并观察1周后，即行配种。配种成功约4~6周后，陆续产出新生鼠，取1~2 d新生鼠用于实验。FITC antimouse sca1、PE antimouse CD 117、PE Cy 5 antimouse MHC class Ⅱ、FITC antimouse CD 34、PE antimouse CD 8 均购自ebioscience公司。
1.2 心肌干细胞的培养与传代 将刚出生的小鼠置于75% 酒精内消毒后剪取心脏，立即置于预先加入DPBS液的培养皿中，剪成约0.5～1 mm3的组织块，用DPBS液反复冲洗。然后加入0.2%胰酶2～3 ml，37oC，5%CO2恒温水浴培养箱中消化5 min，弃去消化液，重复3次。加入少量CEM培养液（成份：IMDM，10%胎牛血清，100 u/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L L谷氨酰胺，0.1 mmol/L 2巯基乙醇）终止消化反应，用吸管反复吹打组织块，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入CEM培养液至培养皿中，用吸管轻轻将其吹打成组织块悬液，再将悬液吸出移入培养瓶中，于37oC，5%CO2恒温水浴培养箱中培养。约24 h后于倒置显微镜下可观察到组织块已经贴壁，并且可以观察到从其周围爬出小而圆的细胞，2～3 d换液1次，观察细胞生长情况。约1周左右，细胞增殖至铺满整个培养瓶底，可进行传代，弃去培养液，用DPBS液清洗3次[1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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