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过敏性紫癜患儿静脉血ICAM |
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用儿科学诊断标准确诊［3］。其中男5例，女8例，年龄4 ～14岁，平均8.3岁，病程1～8天。正常对照组为健康儿童5名，其中男3名，女2名，年龄6 ～14岁，平均9.8岁，抽血前1周内无发热及用药史。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取：患儿及健康儿静脉血3～5 ml，肝素抗凝(生理盐水稀释)，沿离心管壁 加到Ficoll分离液上层，两者比例为2∶1，2 000 r/min离心20分钟，取单个核细胞层，PBS 洗涤后，将细胞溶于1 ml变性液(4 mmol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠(pH 7.0) ，0.5%十二烷基肌酸钠，1%β-巯基乙醇)，液氮中匀浆后，依次加入0.1 ml 2 mmol/L醋 酸钠(pH 4.0)，1 ml饱和酚，0.2 ml氯仿/异戊醇(49∶1)，振荡混匀后，冰浴15分钟；4 ℃ 15 000 r/min离心20分钟，取水相加入等体积异丙醇，－20 ℃沉淀1小时，15 000 r/min离心20分钟，将沉淀再溶于500 μl的变性液中，65 ℃孵育5分钟后，重复上述步骤。 RNA沉淀(4 ℃，15 000 r/min离心20分钟)经80%乙醇洗涤，空气干燥后溶于20 μl DEPD水 中。紫外分光光度计测量浓度和纯度，－70 ℃保存备用。
1.2.2 cDNA合成：在50 μl的反应体系中，加入RNA 10 μg，RNasin 20 U，2.5 mmol dNTP 2 μl，500 ng Random Primer，5×RT buffer 10 μl，AMV-反转录酶10 U。42 ℃ 孵育1小时，95 ℃ 5分钟灭活，加水稀释1倍，－70 ℃保存备用。
1.2.3 引物：引物根据已发表的文献，在中国科学院微生物研究所合成。其序列如下： β2微球蛋白(β2-M)［4］产物长度306 bp。5′-AGT-ATG-CCT-GCC-GTG- TGA-AC-3′5′-AGA-TCC-TCC-CGA-CCG-TTG-AA-3′。ICAM-1［5］产物长 度234bp。5′-TAT-GGC-AAC-GAC-TCC-TTC-T-3′5′-CAT-TCA-GCG-TCA-CCT- TGG-3′。
1.2.4 PCR：反应体系50 μl，内含cDNA稀释物10 μl，dNTP 200 μmol，引物各0.5 μmol，Tag-DNA聚合酶3 U，10×PCR缓冲液5 μl。PTC100型热循环仪上，分别扩增 β2-M和ICAM-1。94 ℃变性5分钟后，94 ℃再变性1分钟，50 ℃(β2-M)或55 ℃(IC AM-1)退火1分钟，72 ℃延伸1分钟，循环35次，72 ℃再延伸5分钟。
1.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳根据Sambrook等［6］(198 9)的方法进行。电泳缓冲液为1×TBE(0.89 mol Tris-HCL，pH 8.0，0.89 mol硼酸，0 .02 mol EDTA)。上述PCR产物加样于2.0%琼脂糖凝胶上，溴化乙锭染色。紫外灯下观察结 果。
1.2.6 PCR产物定量标化：β2-M扩增产物各10 μl，2.0%的琼脂糖凝胶电泳(50 V， 2小时)，GDS—7500紫外凝胶分析系统上照像。用图像分析仪测定电泳图中β2-M的cDNA 条带的亮度和面积，亮度和面积的乘积为电泳条带中cDNA的相对含量。在β2-M量一致情 况下，决定ICAM-1 cDNA的扩增加样量，并计算ICAM-1的表达量。
1.3 统计学处理
应用SPSS软件行秩和检验。
2 结 果
1996年10月至1997年10月我院儿科收治的过敏性紫癜患儿13例，健康儿童5名，外周静脉采 血，分离白细胞。各患儿的主要临床表现见表1。
表1 13例过敏性紫癜患儿临床特征及ICAM-1的相对表达量
编
号 年
龄 性
别 紫
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