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肿瘤坏死因子对鼠甲状腺细胞钙离子的作用 |
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NF-α(103U/L，104U/L和105U/L)。(2)联合用药的作用：①实验时先加TSH，再加TNF-α；②实验前预先加入TNF-α(105U/L)，室温放置10分钟，实验时加入TSH(5U/L)，观察细胞因子的干预对TSH作用的影响。
2.细胞培养：细胞培养液配制成含TSH的6种激素培养液(6H培养液)和不含TSH的5H培养液，将FRTL-5细胞接种于96孔板，每孔约2×104个细胞，于接种后4～6天进行实验。实验前细胞再以5H培养液培养3天。
3.细胞内Ca2+测定：待测细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加入10μmol/L Fluo-3AM，于37℃温育50分钟。将Fluo-3负载的细胞置于INSIGHT Plus倒置显微镜，以488nm波长的氩离子激光扫描，可得到FRTL-5细胞的荧光图像。圈定预定观察的细胞，以6～10秒的间隔连续扫描，总时间为6～10分钟。根据需要在扫描前及扫描过程中加不同浓度的TNF-α。扫描所得一系列荧光图像经LSCM附带的INSIGHT-IQ分析软件进行分析处理，可得到细胞内Ca2+变化的时间效应(相对荧光强度值)曲线。实验时设定相同的激光扫描强度、增益等参数，以保证不同批次实验的稳定性。每组实验重复2次以上。
结 果
一、TNF-α对FRTL-5细胞内Ca2+的作用
TNF-α可降低FRTL-5细胞基础的Ca2+水平。TNF-α103U/L可轻度降低细胞内Ca2+水平，其效应随TNF-α浓度的增加而增强，104U/L和105U/L均可使细胞内Ca2+明显降低(图1)。TNF-α降低FRTL-5细胞内Ca2+水平的模式包括开始数十秒内的快速下降及随后的缓慢下降，或维持在较低的水平。
二、TNF-α对TSH刺激的FRTL-5细胞内Ca2+的作用
TNF-α还可降低TSH(5U/L)刺激后细胞内升高的Ca2+(图2a)，将测定孔培养液中预先加入TNF-α105U/L(10分钟)，则TSH(5U/L)刺激不能再使细胞内Ca2+水平升高(图2b)。
讨 论
Ins/Ca2+系统代谢的主要途径是在磷脂酶C(PLC)的作用下，磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解为肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DG)两个第二信使。IP3的作用主要是介导细胞内Ca2+的动员〔1〕，它与细胞器质膜上的IP3受体结合后，使Ca2+由细胞内钙库释放，导致细胞内Ca2+浓度升高。此外，细胞内Ca2+的增加也部分来源于细胞外Ca2+内流。因此，受体介导的细胞内Ca2+变化是Ins/Ca2+系统调节的中心环节。
LSCM系用独特的共聚焦光学系统，使分辨率明显提高。利用LSCM，可对单个培养的细胞进行实时Ca2+变化的监测。Fluo-3是一种单波长可见激光激发的Ca2+敏感的荧光探针，它以Fluo-3AM的形式通过细胞膜进入细胞浆内，在细胞内酯酶的作用下经水解去除AM基，成为游离形式的Fluo-3，与游离的Ca2+结合，在488nm波长的氩离子激光激发下则发出很强的荧光。其荧光强度随与Ca2+
图1 不同浓度TNF-α对FRTL-5细胞内Ca2+的作用
Fig 1 Effect of different concentration of TNF-α on cytosolic Ca2+ in FRTL-5 cells
(荧光强度代表相对Ca2+浓度，箭头为加药时刻)
(The fluorescence intensity represents the concen tration of Ca2+, the arrow points to the time of adding drugs)
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