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胰淀素对大鼠胰岛素分泌的影响及其机理的探讨 |
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3850D，正常情况下Amylin与胰岛素(Insulin, Ins)共同存在于胰岛B细胞分泌囊泡中，生理量葡萄糖刺激下与Ins同步分泌，是近年来才被确认的一种激素〔1〕，对其生理功能尚不完全清楚，但已发现在高糖刺激下它的分泌远远超过Ins，这使局部Amylin浓度增高成为胰岛内淀粉样蛋白形成的前提〔2〕。临床病理发现：90%左右的2型糖尿病患者，其胰岛中沉积大量胰岛淀粉样蛋白，沉积量与临床糖代谢障碍程度正相关〔3〕。认为2型糖尿病患者在疾病进展过程中，自身胰岛分泌的胰岛素由正常或超正常量发展到分泌减少的变化，可能与胰岛淀粉样蛋白的沉积有关。国内外已报道高浓度Amylin抑制大鼠胰岛细胞分泌胰岛素，影响糖代谢〔4，5，6〕。本研究从不同浓度Amylin作用下胰岛细胞内Ca++和cAMP含量的变化，探讨其对Ins释放影响的机理。
材料与方法
一、材料
1.试剂：胰淀素标准品、Fura-2乙酰羟甲酯(Fura-2/Am)、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、Triton X-100、RPMI-1640培养基等，均购自Sigma公司，cAMP放免试剂盒购自中国原子能研究院。Ins放免试剂盒购自中美合资德普生物制品公司。日产Cobator 5%CO2细胞培养箱等等。
2.胰岛细胞制备和培养：用日龄3天的SD大鼠，无菌取出胰腺，清除胰外组织，剪成0.5mm3碎片，置Hank s液洗3次，用0.2%胰蛋白酶和2mg/mlⅤ型胶原酶，在37℃水浴中消化，用冷Hank s 液终止消化，收集胰岛细胞接种在RPMI-1640培养液中，在5%CO237℃培养箱培养。接种15～20小时，观察细胞生长状态，确认生长良好后，转皿，继续培养48～72小时后用碘乙酸2.5ng/ml处理5～6小时，酌情重复处理至成纤维细胞消失，胰岛细胞充分铺开形式良好的细胞单层(图1，2)。免疫组化染色可见胰岛B细胞占66%(图3)，生物功能鉴定后表明，培养两周内的胰岛细胞对高糖刺激具有良好的反应能力，各项参数表明胰岛细胞功能和形态良好，较成功地提供了实验用胰岛细胞〔6〕。
图1 培养第7天的贴壁胰岛细胞
Fig 1 Adhesion islet cell on 7th day of culture
图2 培养第8天的贴壁胰岛细胞
Fig 2 Adhesion islet cell on 8th day of culture
图3 胰岛素抗体标记的胰岛B细胞
Fig 3 Islet B cell labelled with insulin antibody
图4 胰岛B细胞胰岛素颗粒 电镜8000倍
Fig 4 Insulin granule of islet B cell Electron microscope,×8000
二、方法
1.Amylin对Ins分泌的影响
将前述方法所获胰岛细胞分成五组，每组8皿，每皿细胞数1×106/ml，将每组培养液离心后取上清液测胰岛素作为基础值。然后用含0.1%白明胶的KRB缓冲液(葡萄糖2.8mmol/L)洗涤细胞两次，再用其孵育15分钟后弃上清，然后将第1、2组作为对照组，第3、4、5组作为实验组分别加入浓度为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L Amylin孵育30分钟，再给2～5组加入16.7mmol/L葡萄糖以进行高糖刺激试验，孵育2小时后取上清液测胰岛素含量。
2.Amylin对胰岛细胞内Ca++和cAMP含量的影响
(1)细胞内Ca测定〔7〕：将胰岛细胞用含0.1%白明胶,含Ca++1.5mmol/L的KRB液制成细胞悬液，细胞数为1×106/ml/皿，每皿加入Fura-2/Am，使浓度为5μmol/L，在37℃水浴震荡孵育40分钟，再用不含Fura-2/Am的KRB液洗3次，以去除细胞外的Fura-2/Am，然后用台酚兰染色检测，证实细胞存活率＞90%以上者，再在不同实验条件下测荧光值F。随后加入TritonX-100(浓度为0.1%)以破坏细胞膜，使胞内剩余的Fura-2完全释放到细胞外液中，与细胞外钙结合，测荧光值Fmax，再加入EGTA贮存液浓度为3.5mmol/L，此时Ca++全部与EGTA螯合，Fura-2游离出来，再测荧光值Fmin，(其中F为Fura-2与细胞内Ca++结合的荧光值，Fmax为Fura-2与细胞内外Ca上一页 [1] [2] [3] 下一页
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