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孕酮从基因水平调节骨钙素的合成 |
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激素的影响，如活性维生素D3，甲状旁腺素，糖皮质激素等。尽管临床观察已证实孕激素具有增加骨形成的作用〔2，3〕，但孕激素是否也参与骨钙素合成的调节至今不甚清楚。为此，本文通过胎鼠头盖骨成骨细胞的培养观察孕酮对骨钙素合成的影响及其机制。
材料和方法
一、细胞培养
原代细胞按前述的方法〔4〕从21天龄的SD胎鼠头盖骨分离所得。存活的细胞分别接种于80cm2培养瓶及6孔培养板中，接种密度为0.2×104个细胞/cm2。培养液为不含苯酚的α-MEM，含10%的经炭预处理过的胎牛血清及抗生素。细胞被置于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养24小时，然后用含有50μg/ml抗坏血酸及10mmol/L β-磷酸甘油及前述各种成份的α-MEM换去原培养液。实验组的培养液中另加入10-6mol/L孕酮(Progesterone)，部分实验为10-9～10-6mol/L孕酮，所选用的孕酮浓度是参照文献中已报道具有调节作用的浓度，其后每周换相应培养液两次。
所用培养液、血清、抗生素等购于Gibco(Life Technologies, European Divison)，药品购于Sigma(St. Louis, Mo)。
二、培养液中骨钙素含量的测定
培养在6孔培养板中的细胞用于观察骨钙素分泌量。所用孕酮为10-6mol/L。第5、7、9、11、13、15、17天的培养液收集后立即贮存于-80℃。于测定当天取出标本，室温解冻后立即测定。样本中的骨钙素含量用鼠骨钙素RIA药盒(Biomedical Technologies Inc, Stoughton, MA)测得。
三、Northern印迹杂交分析
用于mRNA分析的样本来源于两组培养细胞。一组培养时间及所用激素浓度同上述骨钙素含量测定的实验，用于观察孕酮对培养的不同时期骨钙素基因表达的影响。细胞收集时间基本同上。另一组为加有10-9～10-6mol/L的孕酮，在实验的第11天收集细胞以观察不同剂量孕酮的影响。RNA分离及杂交过程参见〔5〕。样本中的骨钙素mRNA用一特异的完整编码鼠类骨钙素cDNA序列的寡核苷酸探针(5 -TGCCCTCCTGCTTGGACATGAAGG-3 )所测定。寡核苷酸探针用γ-32ATP做末端标记。为校正各样本上样的差异，杂交膜用32P末端标记的28 S RNA寡核苷酸探针再杂交。mRNA的含量通过Molecular Dynamics Phosphor Imager SF测定。
结 果
离体胎鼠头盖骨成骨细胞在培养第5天见细胞融合。第7天出现稚型骨小结。骨小结在11天左
图1 孕酮对培养的不同时间成骨细胞骨钙素生成的影响
Fig 1 Effect of progesterone on osteocalcin production by osteoblast at different culture time
●：激素组 Progesterone group；○：对照组 Control group；*P＜0.01
图2 定量分析所示孕酮对不同时间骨钙素mRNA表达的影响
Fig 2 Quantitative analysis showed the effect of progesterone on osteocalcin mRNA expression at different culture time
●：激素组 Progesterone group；○：对照组 Control group；**P＜0.01，*P＜0.05
图3 不同剂量孕酮对骨钙素mRNA表达的影响
Fig 3 Effect of different concentration of progesterone on osteocalcin mRNA expression
* P＜0.01
右完全形成，从第13天起培养中便可观察到骨小结的逐渐矿化。第17天中止实验。
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