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甾体5 |
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孙祖越* 郑维君 王晓麟 屠曾宏
甾体5α-还原酶〔1〕是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，依赖还原型辅酶II(NADPH)作为供氢体，催化一系列甾体底物上Δ4，5双键的还原作用，并使C-5位上的氢加成到α位上〔2〕。甾体5α-还原酶有I型和II型区分，两者各有不同的最适pH值，前者为7～9，后者为5.5〔3〕。该酶不可逆地催化睾丸酮(T)转为生理活性更强的双氢睾丸酮(DHT)〔4〕。DHT被认为是良性前列腺增生症(Benign prostatic hyperplsia，BPH)的主要病因〔5〕，抑制该酶活性，减少DHT生成，可能是BPH非手术治疗的主要途径〔6〕。为了克服测定该酶活性通常所采用的同位素方法难以避免的缺憾，我们创建了简便快捷、经济实用的分光光度计测定方法。
一、材料与方法
1.Tris缓冲液配方：Tris 1214mg，EDTA-Na2 18mg,MgCl2*6H2O 1020mg,二羟基乙醇40mg，NaCl 2.92g，蔗糖45g，并加蒸馏水至1000ml。用盐酸调pH至7.0。
2.甾体5α-还原酶制备：取3只雌性Sprague-Dawely大白鼠(体重301±11克，由中国科学院上海实验动物中心提供)，禁食一夜后取肝脏浸入上述Tris缓冲液中，于0℃条件下匀浆，依次作10000g 30min和105000g 1hr离心，制备出作为甾体5α-还原酶载体的肝脏微粒体悬液，置于-70℃冰箱备用，如此可保存至少1个月。
3.试剂与仪器：(1)睾丸酮：Sigma化学公司产，用无水乙醇(AR)溶解经Tris缓冲液稀释，至反应时最终为0、4、5、6、8、12、24和40μmol/L系列浓度，其中0浓度为空白对照。(2)NADPH：Sigma化学公司产，用Tris缓冲液配制，至反应时最终浓度为22μmol/L。(3)紫外光栅分光光度计：型号：752，上海第三分析仪器厂生产。
4.实验方法及步骤：将系列浓度T、甾体5α-还原酶制备液、NADPH和Tris缓冲液一起作37℃连续孵育，用紫外光栅分光光度计在340nm处连续测定NADPH的特征吸收波长OD值的时间变化曲线。根据NADPH标准曲线折算出作为酶学反应底物NADPH 10min内的浓度下降速率(μmol*L-1*min-1)，扣除空白对照管的下降速率(nmol*L-1*min-1)，即为酶活性〔7〕。进一步以各浓度管中酶活性对T浓度通过GraphPAD InPlot (GraphPAD Softwar Inc.)统计软件，再由Lineweaver-Burk倒数作图法求出大白鼠肝脏甾体5α-还原酶米氏常数Km值〔8〕。
二、结果
1.NADPH标准曲线
配制NADPH浓度系列测定OD340nm值，绘制标准曲线。在实验前、中、后分别作相同的标准曲线，合并后得方程OD340nm=0.004857×NADPH(μmol/L)，r=0.9971。
2.NADPH(OD340nm)浓度下降曲线及酶活性测定
在37℃孵育时，测定T各浓度管中OD340nm连续下降值，可以绘制下降曲线图，发现各曲线起始段近似直线，故取前10min内各点作直线回归分析得彼此的下降率，并以此分别减去空白对照管的下降率，所得数据即为酶活性。结果T为4、5、6、8、12、24和40μmol/L各浓度管的酶活性(v)分别为0.2110±0.0095、0.2218±0.0134、0.2446±0.0043、0.2641±0.0055、0.3079±0.0049、0.3340±0.0122和0.3623±0.0264μmol*L-1*min-1。将上述两组数据经Lineweaver-Burk倒数法作图，得直线方程为Y=9.0784X+2.5756，r=0.9940(Y轴：1/v;X轴：1/T)，由此计算出大白鼠肝脏甾体5α-还原酶的米氏常数Km=3524.8nmol/L。
三、讨论
在T向DHT的转化过程中，NADPH是必不可少的供氢体〔9〕，同时它也可能作为其它反应的供氢体，是一种非特异性的还原型辅酶〔10〕，因此在实验中设置空白对照组尤为重要，以便测定本底值。在本实验过程中，可以清楚地观[1] [2] 下一页
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