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心力衰竭患者心肌线粒体DNA缺失突变的定量分析及与心功能损害程度的关系 |
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was found in 7 of 10 patients with dilated cardiomyopathy (DCM) and 7 of 18 patients with rheumatic
heart disease (RHD), and comprised 0.009—0.488% of the total. Quantitatively very low mtDNA4977
and mtDNA7436 deletions were detected only in 2 and 2 control hearts respectively. With the rising
of NYHA function class and the enlarged left atrial size, the percentage of mtDNA deletions increased
markedly; and the extent of increase in DCM was more marked than that in RHD. Conclusion The
extent of myocadial mtDNA damage varied closely with the degree of cardiac dysfunction, especially
in patients with DCM.
【Key words】 DNA, mitochondrial mutation heart failure, congestive
心肌线粒体DNA(mtDNA)获得性损伤可能在肥厚衰竭心肌能量代谢失衡中起着重
要作用［1,2］；研究证明，老年心脏及多种心肌疾患均表现有心肌mtDNA 4977 bp
(mtDNA4977)和7436 bp(mt-DNA7436)缺失型突变［3～5］。本文用定量方法，进一步
探讨心肌mtDNA损伤在心力衰竭发生发展中的意义，以及与临床心功能受损程度的关系。
资料和方法
一、对象
28例慢性心力衰竭患者中，扩张型心肌病(DCM)10例，年龄44.0±13.9岁(28～58岁)，
均经右颈内静脉径路行Swan-Ganz导管检查和心内膜心肌活检取材。DCM诊断参照WHO/ISFC
标准。18例风湿性心脏病二尖瓣关闭不全为主换瓣病人(RHD)，年龄40.7±10.8岁(21～62岁)，
均在手术中直视取材，取左室游离壁和后乳头肌基部。10例对照者系健康意外死亡，年
龄29.9±11.4岁(19～52岁)，取左室游离壁心肌，取材距死亡时间不超过30分钟。
二、方法
1.引物设计及PCR扩增：参照Hattori法［6］提取心肌组织总DNA，按常见缺失突变
类型mt-DNA4977和mtDNA7436，共设计了三对引物［6，7］：L820/H1420分别对应于8201～8220
和14220～14201位，可扩增出代表缺失类型mtDNA4977的1.0 kb片段，L853/H38对应于
8531～8550和400～381位，可扩增代表mtDNA7436缺失的1.0 kb片段；L625/H726对应于
6251～6270和7280～7261位，即mtDNA分子高度保守区的COI基因区，可扩增出代表总
mt-DNA的1.0 kb片段，作为内参照，计算mtDNA4977、mtDNA7436占总mtDNA的百分率。
50 μl PCR反应体系中含DNA模板0.4 μg，4×dNTP各200 μmol/L，一对引物各25 pmol,
Taq酶(promega) 2U。用DNA热循环仪95℃预变性10分钟，加入Taq酶后94℃变性60秒，
50℃退火50秒，72℃延伸180秒，36个循环后，72℃继续延伸5分钟，产物用1.2%琼脂
糖凝胶电泳，溴乙淀染色观察并照像。
PCR扩增产物用Dde I酶切、电泳，以鉴定其产物不是非特异性扩增产物。
2.PCR扩增产物定量分析：向扩增体系中加入α-35S-dATP(Dupont, 美国，比活度上一页 [1] [2] [3] 下一页
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