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血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究 |
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tissue ischemia might be
feasible and safe and represent a potential therapeutic strategy.
【Key words】 endothelial growth factors gene therapy collateral circulation
梗塞性血管病包括外周梗塞性血管病、冠状动脉梗塞和脑梗塞，是心脑血管
系统中最严重的一类疾病，目前对这类疾病尚无有效的治疗方法，主要借助于血
管旁路术和血管成形术的治疗，病死率和并发症较高。血管内皮生长因子(vascular
endothelial growth factor, VEGF)，具有特异性促内皮细胞分裂原的作用，可促进新生
血管生长。我们曾经报告［1］，给下肢血管闭塞症大鼠，应用基因缝线进行肌肉
内VEGF基因转移，证明可有效促进血管新生和侧枝循环建立，防止肢体的坏疽。
本研究重组了VEGF真核表达载体，通过基因缝线和注射法，给下肢闭塞性脉管病
的犬，进行再生肌肉内VEGF的基因转移，以期检验在犬的肌肉内转VEGF基因是否
同样可以有效促进血管新生和侧枝循环的建立。
材料与方法
1.动物和手术：选用5只10 kg左右的雄性犬(由北京医科大学第一医院实验动
物中心提供)，应用2%戊巴比妥钠静脉麻醉(30 mg/kg)。转基因前3天，在犬左侧
大腿内侧肌群内多点注射肌肉再生剂0.5%丁哌卡因(bupivacaine)，3天后，左侧
下肢行髂外动脉远端和分枝切断术，造成下肢闭塞性血管病模型，右侧下肢不予
结扎作为对照组。在手术后即刻、14天、28天和4个月，采用右侧股动脉插管行
双侧髂动脉造影术(6F，cordis pigtail)，将导管的头端置于腹主动脉，导管尾
端连接高压注射器以注入76%泛影葡胺，采用连续电影摄影记录造影结果，摄影速
度为25祯/秒，以观察新生血管和侧枝循环的形成状况；同时分别于转基因前、转
基因后14天、28天取犬血清，进行临床生化指标测定，观察转基因对心、肾、肝等
器官功能的影响。
2.质粒的构建：质粒pcDNA3/VEGF为本室构建，构建示意图见前文［1］，采用
大规模裂解法提取质粒，用PEG8 000纯化质粒DNA。将质粒溶于消毒水中，浓度为5μg/L。
3.基因转移：依据本实验室建立的基因缝线法同时多点注射法进行。即将8号
缝合线浸泡于pcDNA3/VEGF的溶液中，8小时后取出缝线在无菌条件下晾干再予浸泡，
反复多次，使每cm缝线含150 μgDNA，将此缝线蛇行缝合于实验组犬的血管结扎侧
大腿肌肉内，埋入缝线长约10 cm，约含1.5 mg pcDNA3/VEGF，将剩余pcDNA3/VEGF
多点浸润注射入肌肉内，对照组应用不含VEGF基因的单纯pcDNA3的缝线同样缝合，28
天后取缝合部位的肌肉组织，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿等方法提取组织总RNA，应用
RT-PCR，观察基因转移的效果和表达状况。VEGF的引物为5′端：5′-GGGGGATCCGCCT
CCGAAACCATGAACTT-3′和3′端：5′-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGATCTGGTT-3′，变性、
延伸、退火的温度分别为94℃、56℃和72℃，共进行40个循环。
图1 转VEGF基因和对照(转pcDNA3)14天血管造影。左图为对照(转pcDNA3)，可见
闭塞血管的近端至远端有少量侧支循环血管形成；右图为转VEGF基因，可见明显增
多的侧支循环血管。箭头所指部位为两者侧支循环血管差别最明显的部位
4.材料：工具酶及化学试剂购美国Sigma公司。
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