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肿瘤坏死因子 对Graves病患者甲状腺细胞基因表达的影响 |
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of 0.01U/ml did not affect TSH-induced TPO mRNA levels, but TNFα at 1～1000U/ml significantly decreased TSH-induced TPO mRNA. Conclusion TNFα directly affects TG and TPO gene transcription in cultured human thyrocytes without TSH and TNFα does not affect TSH-stimulated TG, TPO mRNA levels at lower doses while decreases these levels at higher doses.
【Key words】 TNFα Thyroglobulin Thyroid peroxidas Thyrocyte mRNA
(Chin J Endocrinol Metab, 1999, 15:31-34)
细胞因子是介导免疫反应的重要的调节因子，它和自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的免疫病理过程密切相关。细胞因子不仅参与形成甲状腺的免疫紊乱，从而影响着甲状腺细胞的多种功能活动，如摄碘、碘的有机化、甲状腺球蛋白(TG)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、促甲状腺素(TSH)受体(TSHR)的合成等功能及代谢过程〔1〕。在众多的细胞因子中，白细胞介素(IL1)、IL6、IL8、干扰素γ(IFNγ)对甲状腺功能的影响研究得较为充分，有了比较一致的意见，但关于肿瘤坏死因子α(TNFα)对甲状腺功能的调节作用，目前了解得尚少。为此，本文从细胞水平和分子水平上系统地研究TNFα在不同剂量和不同状况下对甲状腺细胞TG、TPO mRNA表达的调节作用，从而深入探讨TNFα在AITD形成和发展过程中可能具有的作用和意义。
材料和方法
一、甲状腺细胞培养
取甲亢患者手术切除的甲状腺组织，去包膜及反复洗涤后剪切成1mm3大小的碎片，以0.25%胰酶及0.03%胶原酶(Sigma)消化60～90分钟，充分吹打并用不锈钢筛过滤，用含15%小牛血清和适量抗生素的Eagle s培养液(Sigma)调整细胞浓度，并作活细胞计数。最后于细胞培养瓶中加入甲状腺细胞悬液，浓度为107个细胞/ml，置37℃含5% CO2的细胞培养箱中温育7天，隔天换液1次。细胞培养7天后用含或不含TSH(Sigma)的不同浓度的TNFα(Sigma)刺激细胞生长72小时。
二、总RNA抽提
细胞培养72小时后，收集细胞，各加入变性液D〔含4mmol/L异硫氰酸胍(Sigma)，5g/L Sarcosyl, 25mmol/L柠檬酸钠pH 7.0，0.1mol/L β-巯基乙醇〕10ml,水饱和酚(pH 7.0)10ml，醋酸钠(4mmol/L,pH 4.0)1ml，氯仿/异戊醇(49:1)4ml，离心后取上清，再以-20℃异丙醇进行沉淀，并以-20℃乙醇(70%)洗涤沉淀，将RNA溶于DEPC处理过的H2O中，取少量检测OD260/OD280，比值约为1.96，总RNA浓度为1.2μg/μl，取少量进行电泳分析，28S:18S约2:1，表明RNA未被降解。
三、RNA电泳和转移
制备甲醛变性琼脂糖凝胶，RNA电泳后，通过毛细吸管法转移到Hybond尼龙膜上(Amersham, Japan)，于80℃干烤60分钟，使RNA交联于尼龙膜上。
四、探针的制备、杂交、放射自显影
制 备感受态 HB101菌株，将含TG及TPO cDNA片段的质粒PBR322、PBSM13-(ATCC，America)进行转化反应，经鉴定后，进行扩增、提取、纯化，分别以限制性核酸内切酶Pst I及EcoR I、Pvu I 进行酶切反 应，使用Glassmilk Kit (Pharmacia)回收TG、TPO cDNA片段，大小分别为980bp、3 000bp。用随机引物法，以32P标记TG、TPO及GAPDH cDNA(南京铁道医学院科研所提供)片段，比活度为108cpm/μg。尼龙膜进行预杂交后，加入TG、TPO探针杂交过夜，洗膜后，在暗室中压片，置-70℃放射自显影48小时，并经显影、定影可观察到杂交条带。尼龙膜于0.1&ti上一页 [1] [2] [3] 下一页
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